失血性休克后Pyrin在肺NLRP3炎症小体活化中的作用及机制研究

摘要

失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)能够通过启动机体固有免疫系统，触发全身炎症反应，甚至导致多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)的发生。这一病理过程中，炎症启动的机理尚不明了。IL-1β在休克后全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）中有着重要的作用，炎症小体控制着IL-1β的成熟和释放。Pyrin蛋白由781个氨基酸组成，通过与核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白(Nucleotide-binding oligomerizationdomain-like receptor protein，NLRP)相互作用，可以抑制炎症小体的活化。内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)以及细胞因子能够诱导Pyrin蛋白表达增加;在巨噬细胞，白细胞介素(Interluekin-10，IL-10)能够诱导Pyrin的表达上调。本课题试图证实失血性休克后， IL-10水平下调，Pyrin表达降低，炎症小体的活化失去负向调控，进而IL-1β在肺脏内的成熟及分泌增加，炎症反应过程进一步被放大。研究结果显示，LPS在肺内激活了NLRP3炎症小体的同时，也通过诱导IL-10上调了Pyrin的表达，抑制了炎症小体的活化。更为重要的是，LPS介导的IL-10能够上调Pyrin表达，在炎症后期，Pyrin通过抑制炎症小体活化，控制了炎症反应的发展。失血性休克后，IL-10在肺巨噬细胞（Alveolar macrophages，AM）内的表达减少，Pyrin在AM以及肺内皮细胞中表达降低，进而炎症小体活化增强，IL-1β分泌增加。本课题提出并阐释了新的失血性休克后炎症反应启动机制:失血性休克抑制了LPS介导的NLRP3炎症小体活化和IL-1β分泌的负反馈调节机制。
　　 第一部分:失血性休克增强内毒素诱导的肺组织内NLRP3炎症小体活化
　　 1.内毒素诱导的肺组织内NLRP3炎症小体活化能够被失血性休克所增强通过测定NLRP3和ASC的结合以及caspase-1的剪切成熟来判断肺内炎症小体的活化情况。通过野生型及NLPR3-/-小鼠，在失血性休克复苏后2小时气管内给予LPS或生理盐液注射，应用免疫共沉淀及免疫印迹方法测定肺组织NLRP3及ASC的结合以及caspase-1的剪切成熟，ELISA方法测定肺泡灌洗液中IL-1β水平。结果表明，失血性休克通过激活NLPR3-/-炎症小体从而增加了IL-1β的成熟、分泌。
　　 2.肺巨噬细胞在肺组织炎症小体活化中起主要作用
　　 为明确肺巨噬细胞在肺组织的炎症小体活化中所起的作用，小鼠失血性休克复苏2小时后进行肺泡灌洗，利用免疫磁珠分离系统纯化得到肺巨噬细胞。肺巨噬细胞体外给予LPS刺激(1μg/ml)，测定炎症小体活化、caspase-1剪切成熟及IL-1β的释放。相比假手术组，在失血性休克组来源的肺巨噬细胞中，给予LPS刺激后，发生了更为显著的NLRP3和ASC结合、caspase-1剪切以及IL-1β释放。LPS诱导的肺组织及肺巨噬细胞内NLRP3炎症小体活化能够被失血性休克所增强。
　　 第二部分:失血性休克与Pyrin蛋白对肺组织炎症小体活化的作用机制研究
　　 1.失血性休克损害了肺内Pyrin蛋白表达上调
　　 Pyrin蛋白被认为能够抑制caspase-1活化及IL-1β成熟释放(13，20)。为明确失血性休克后，Pyrin蛋白对肺内炎症小体活化的调节，首先测定了失血性休克和/或LPS刺激后Pyrin蛋白在肺组织及巨噬细胞内的表达水平。在HS-LPS“两次打击”后，失血性休克明显降低了Pyrin蛋白在肺内的表达。小鼠肺巨噬细胞体外LPS刺激后，得到了类似的结果:LPS刺激后，假手术组来源的肺巨噬细胞Pyrin蛋白表达上调，而失血性休克组，失血性休克明显削弱了LPS诱导的Pyrin表达增加。
　　 2.失血性休克通过削弱IL-10产生抑制了Pyrin蛋白表达
　　 有文献报道，IL-10可以通过Jak3，Stat6以及NF-κB途径来诱导Pyrin蛋白的表达(20)。我们先前研究已经证明失血性休克降低了IL-10的表达，从而肺部炎症反应加重(29)。本研究中，我们进一步证实，通过TLR4及MyD88信号通路，LPS诱导了IL-10的肺内表达。在假手术和失血性休克组，外源性IL-10明显诱导了Pyrin蛋白在肺内的表达;重组IL-10与LPS复合注射，诱导了更高的表达量;而给予IL-10中和性抗体，无论假手术组或失血性休克组，Pyrin蛋白表达未见增加。以上研究表明，IL-10表达上调受损，导致了HS-LPS“两次打击”后Pyrin蛋白表达上调被抑制，炎症晚期更为明显。
　　 3.Pyrin蛋白表达减少导致了失血性休克介导的炎症小体激活
　　 为论证IL-10、Pyrin蛋白以及NLRP3炎症小体之间的关系，我们运用了siRNA技术，使鼠肺血管内皮细胞(Mouse lung vascular endothelial cell，MLVEC)内Pyrin蛋白表达沉默。转染后48小时，在LPS或IL-10诱导下，MLVEC细胞中Pyrin蛋白表达明显受损，LPS诱导的NLRP3-ASC结合明显增加，caspase-1剪切以及IL-1β释放也明显增加。Pyrin蛋白敲除后，即使给予外源性重组IL-10，MLVEC细胞的炎症小体活化及IL-1β释放并未减少，提示IL-10降低炎症小体活化的作用是通过Pyrin蛋白介导的。
　　 综上所述，我们获得以下结论:
　　 1.失血性休克能够增强LPS诱导的肺部炎症小体活化;
　　 2.肺巨噬细胞在肺组织炎症小体活化中起主要作用;
　　 3.失血性休克后抑炎因子IL-10表达受损，导致肺部炎症增强;
　　 4.失血性休克通过削弱IL-10产生从而抑制了Pyrin蛋白表达;
　　 5.Pyrin蛋白表达减少导致了失血性休克介导的炎症小体激活。
　　 本研究揭示了失血性休克致炎的新的机制，失血性休克通过抑制了LPS刺激后的炎症小体活化负反馈调节通路，能够增加促炎因子IL-1β的肺内表达，进而促进了炎症的发展。研究失血性休克后炎症反应中IL-10和Pyrin蛋白的调节规律，具有启发性意义。维持IL-10和/或Pyrin的表达或许能够为失血性休克后炎症反应的治疗提供新思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分：失血性休克增强内毒素诱导的肺组织内NLRP3炎症小体活化

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

第二部分：失血性休克与Pyrin蛋白对肺组织炎症小体活化的作用机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

全文总结

参考文献

发表论文

综述一 NLRP3炎症小体活化的分子机制研究进展

综述二：美国创伤失血性休克液体复苏研究现状分析

致谢