CGRP上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究

摘要

研究目的:
　　 牙周炎发生的初始原因是细菌、毒素因子和机体间的防御功能的平衡被打破所致。越来越多的研究表明与遗传有关的宿主易感性是牙周炎发病过程中的主要决定因素之一。
　　 近年来，牙周病易感因素与基因多态性方面的研究渐渐受到重视。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)阳性神经纤维广泛分布于牙周组织，特别是牙周炎的起始部位。有研究表明牙周组织受到外界刺激后，CGRP等神经肽可以通过特定的机制，调节口腔组织中的成骨细胞、骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞以及血管的功能。另有研究表明CGRP是骨细胞的活性调节因子，可以促进成骨分化及骨组织的形成。并且一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖，并对细胞表面黏附分子起促进作用。
　　 研究证实，CGRP对人牙周膜成纤维细胞影响主要在于CGRP可促进人牙周膜成纤维细胞的增殖、胶原合成、成骨分化等。但是对于CGRP在人牙周膜成纤维细胞的纤维钙化方面的信号转导通路的研究国内外鲜见报道。本研究试图初步探讨CGRP对人牙周膜细胞细胞增殖、胶原合成、纤维钙化等作用可能涉及的信号通路。
　　 研究方法:
　　 第一部分:临床采集健康牙齿，采用酶消化+组织贴附法，进行人牙周膜成纤维细胞原代培养。运用sABC法，进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色，对人牙周膜成纤维细胞进行形态学观察和免疫组织化学鉴定。以CGRP-A和CGRP-C基因为目的基因，以腺病毒为载体，采用腺病毒构建技术，构建CGRP基因重组腺病毒(Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C)，感染人牙周膜成纤维细胞，并加以鉴定，作为细胞实验的基础。
　　 第二部分:通过Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72h，运用细胞流式检测、定量PCR测定和Western-blot测定的方法，检测人牙周膜成纤维细胞增殖、凋亡水平变化、胶原合成分泌水平变化，以及MMP-2、MMP-9、OPN、CAP-3、ALP等效应蛋白的表达水平变化。探讨CGRP-A、CGRP-C基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响。
　　 第三部分:在单因素Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C感染人牙周膜成纤维细胞后培养72小时，运用定量PCR测定和Western-blot测定的方法，进一步检测BMP-2、BMP-4、BMP-7、TGF-β等细胞因子的变化。在分子水平上探讨CGRP多态性基因作用于人牙周膜成纤维细胞后，对人牙周膜成纤维细胞的细胞增殖、胶原合成纤维化，成骨钙化等作用可能涉及的信号通路。
　　 结果:
　　 1、原代细胞培养成功，免疫荧光染色鉴定:波形丝蛋白染色呈阳性，角蛋白染色呈阴性，并选取四个细胞株作为后两部分实验的材料。
　　 2、成功构建降钙素基因相关肽的重组腺病毒Ad.CGRP-A和Ad.CGRP-C，并感染人牙周膜成纤维细胞表达降钙素基因相关肽。
　　 3、细胞流式检测显示:Ad.CGRP-A处理组处于S/G2/M期的细胞比例显著高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组。Ad.CGRP-C处理组处于S/G2/M期的细胞比例显著低于空病毒对照组。
　　 4、定量PCR检测和Western-blot测定部分细胞外基质胶原蛋白(COL)、金属蛋白酶(MMP)、成骨分化标志物(ALP)及凋亡蛋白酶-3(CAP-3)基因结果显示:(1) Ad.CGRP-A处理组COLI、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白表达水平显著高于Ad.CGRP-C处理组和空病毒对照组;Ad.CGRP-C处理组COLI、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白表达水平显著低于空病毒对照组。
　　 (2) Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组MMP-2的相对表达水平显著高于空病毒对照组;且Ad.CGRP-C处理组的相对表达水平显著高于Ad.CGRP-A处理组;MMP-9表达含量较低，没有检测到结果。
　　 (3) Ad.CGRP-A处理组蛋白ALP的相对表达水平明显高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组无明显差异。
　　 (4) Ad.CGRP-A处理组蛋白OPN的相对表达水平明显高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-C处理组相对表达水平显著低于Ad.CGRP-A处理组与空病毒对照组。
　　 (5) Ad.CGRP-A处理组和Ad.CGRP-C处理组的CAP-3相对表达水平与空病毒对照组CAP-3的相对表达水平无明显差异。
　　 5、定量PCR检测和Western-blot测定，TGF及BMP家族基因表达结果显示:
　　 (1)在观察促成骨钙化的研究试验中，通过对BMP-2、MBP-4、BMP-7几个细胞因子的定量PCR实验结果显示: Ad.CGRP-A处理组BMP-2表达显著高于空病毒对照组和Ad.CGRP-C处理组;但是Ad.CGRP-C处理组BMP-2表达水平与空病毒对照组无显著差异;BMP-4组中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组与空病毒对照组之间的相对表达水平无显著差异;BMP-7表达含量较低，没有检测到结果。
　　 (2)在观察促纤维化的研究试验中，Ad.CGRP-A、Ad.CGRP-C处理组TGF-β的相对表达水平均高于空病毒对照组;而Ad.CGRP-A处理组相对表达水平低于Ad.CGRP-C处理组。
　　 结论:
　　 1、CGRP-A显著促人牙周膜成纤维细胞高表达BMP-2、OPN及ALP，提示CGRP通过激活BMP-2途径促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。CGRP-C可显著抑制人牙周膜成纤维细胞中OPN表达，对BMP-2和ALP表达无显著影响，提示CGRP基因+5247位点的单核甘酸多态性显著影响CGRP促人牙周膜成纤维细胞成骨分化。
　　 2、CGRP-A显著促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β、COLI型、COLⅢ型、COLⅣ型，此外CGRP-A显著提高人牙周膜成纤维细胞中S/G2/M期细胞比例，提示CGRP通过激活TGF-β途径促人牙周膜成纤维细胞增殖及纤维化。值得注意的是，尽管CGRP-C也可显著促人牙周膜成纤维细胞高表达TGF-β，但同时CGRP-C显著上调人牙周膜成纤维细胞中MMP-2表达（表达水平较CGRP-A和对照组分别升高4倍和5倍），提示CGRP-C可能通过上调金属蛋白酶表达的途径抑制人牙周膜成纤维细胞的纤维化及增殖能力，但其具体调控机制有待进一步探索。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、研究背景

二、研究意义

第一部分：人牙周膜成纤维细胞的原代培养及表达降钙素基因相关肽(CGRP)的重组腺病毒感染

引言

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分：检测CGRP-A，CGRP-C基因对感染的人牙周膜成纤维细胞纤维钙化作用的影响

引言

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三部分：探讨CGRP-A，CGRP-C基因上调TGF-β/BMP-2表达促牙周膜成纤维细胞纤维钙化的作用机制研究

引言

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

小结

参考文献

综述

致谢