Ophiobolin O通过周期阻滞和凋亡在体内外逆转耐药细胞MCF-7/ADR的机制研究

摘要

越来越多的临床和实验数据表明，乳腺癌为我国常见恶性肿瘤之一，也是我国恶性肿瘤防治研究的重点。死亡率在恶性肿瘤中居第二位，仅次于胃癌和食管癌。手术切除是目前治疗早期乳腺癌唯一有效的方法，但大多数患者就诊时已达病程中晚期，手术疗效受限，因而寻找新的治疗方法尤为重要。随着对肿瘤发生机制的深入研究，探讨诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的方法成为提高临床疗效的新思路。目前临床上治疗肿瘤出现了耐药现象，多药耐药(MDR)系指肿瘤细胞对1种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对其他多种结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性。随着肿瘤化疗药物的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。目前研究肿瘤耐药机制主要是从MDR基因表达的产物入手，探讨此类产物引起的耐药机制。主要有P-糖蛋白(P-gP)、细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽转移酶(GST)、DNA拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ(TOPOⅠ、Ⅱ)、多药耐药相关蛋白（MRP）和肺耐药蛋白(LRP)等。
　　 本课题研究一种新的化合物蛇孢假壳素(ophoiobolin)对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的作用，蛇孢假壳素O是从中国海洋大学提供的12种微生物提取物中筛选出来的抗肿瘤活性较好的化合物，属于蛇孢假壳素类二倍半萜化合物，其分子量为434.39。国内外文献未曾报道过这种化合物的抗肿瘤活性。本论文选取人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/ADR作为实验对象，来研究Ophiobolin O对其增殖，周期和凋亡的影响及其作用机制。
　　 研究目的:研究Ophiobolin O对MCF-7/ADR细胞增殖，周期和凋亡的影响及其作用机制。
　　 研究方法:采用MTT法检测Ophiobolin O对人乳腺癌细胞株MCF-7人乳腺癌耐药细胞株MCf-7/ADR增殖的影响;采用流式细胞仪Propidium Iodide(PI)单标法检测Ophiobolin O对MCF-7/ADR细胞周期进程的影响;Real-time PCR检测耐药基因mRNA表达的变化;采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双标法和PI单标的sub-G1（细胞亚二倍体凋亡峰）法检测细胞凋亡率;应用Hoechst33342和DAPI荧光染色法观察Opho-和ADM处理后细胞形态的变化;western blotting检测凋亡蛋白和周期表达水平;采用流式细胞仪JC-1染色法检测线粒体膜电位（△Ψm）水平;采用流式细胞仪检测荧光探针DCFH-DA标记的细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS);用western blotting检测凋亡通路蛋白表达;用NAC和ROS抑制剂检测JC-1和ROS水平，动物体内实验检测Ophiobolin O和ADM的抑瘤率;转染实验检测细胞内MDR1基因启动子水平高低。
　　 结果:Ophiobolin O可抑制MCF-7/ADR细胞增殖，其作用具有浓度依赖性，在作用MCF-7/ADR细胞48h，后，ADMIC50为6.67±0.16μM，0.1μ M Ophiobolin O作用MCF-7/ADR细胞后流式细胞仪检测细胞周期进程和sub-G1的结果显示，与对照组相比，随着浓度的增高，G2/M期的细胞百分数逐渐增多(p＜0.05)，而S期的细胞百分数逐渐减少(p＜0.05)，G0/G1期细胞百分数基本保持不变，表明Ophiobolin O+ADM阻滞细胞于G2/M期，说明Ophiobolin O具有诱导MCF-7/ADR细胞凋亡的作用。流式细胞仪Annexin V/PI双标检测凋亡率的结果也显示随着药物作用时间的延长，早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)占总细胞数的比例也不断增加(p＜0.05)，进一步证明Ophiobolin O具有诱导MCF-7/ADR凋亡的作用。通过荧光染料Hoechst33342和DAPI检测细胞形态学改变的结果显示Ophiobolin O作用MCF-7/ADR细胞48h后可见典型的凋亡形态学改变，表现为部分细胞胞质缩小，胞质浓缩，核染色体高度凝聚、边缘化，细胞核碎裂呈碎片状，可见典型的新月形凋亡小体，而正常对照组的细胞核完整。Ophiobolin O诱导MCF-7细胞凋亡过程伴随以下一系列细胞内活动:(1)线粒体膜电位降低;(2)暂时增加细胞内活性氧水平;(3)凋亡诱导因子发生从线粒体到核的移位;
　　 结论:Ophiobolin O可抑制MCF-7/ADR细胞增殖，Ophiobolin O具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并能使细胞周期进程发生变化。体内动物实验联合作用后，抑瘤率增高。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

参考文献

第一部分 Ophiobolin O和ADM对人乳腺癌耐阿霉素MCF-7／ADR细胞增殖，凋亡和周期的影响

一、Ophiobolin O和ADM对人乳腺癌耐阿霉素MCF-7／ADR细胞增殖的抑制作用

二、Ophiobolin O对乳腺癌细胞MCF-7／ADR细胞凋亡和周期的影响

第二部分 Ophiobolin O对人乳腺癌细胞MCF-7／ADR耐药基因、蛋白表达水平

一、Ophiobolin O对人乳腺癌细胞MCF-7／ADR耐药基因和蛋白表达水平

二、双荧光素酶活性报告基因检测MDR1启动子质粒转染的表达

参考文献

第三部分 Ophiobolin O对人乳腺癌MCF-7的MAPK信号通路的影响及体内实验

一、Ophiobolin O对人乳腺癌细胞MCF-7／ADR的MAPK信号通路的影响

参考文献

二．动物实验

参考文献

总结

综述

附录 研究生期间投稿的文章

致谢