负载阿霉素和RRM2 siRNA的免疫脂质体抑制肝癌细胞活性

摘要

肝癌是世界上最常见肿瘤之一[1]。目前,针对肿瘤的治疗,化疗和基因治疗的联合运用越来越受到重视,这主要是由于联合用药可以减少毒副作用并加强抑制肿瘤的效果[2,3]。然而,好的联合治疗效果需要慎重的选择所联合使用的药物,而且还要选择一种适当的递送方式将化疗药物和基因药物特异的运送到肿瘤组织。本文展示我们所研究的靶向纳米阳离子脂质体(TLPD),即嵌合抗EGFR抗体片段Fab'的LPD包裹阿霉素(ADR,Adriamycin)和RRM2 siRNA(Ribonucleotide Reductase M2 siRNA),得到ADR-RRM2-TLPD。在本研究中,ADR-RRM2-TLPD能够发挥ADR与RRM2siRNA的联合治疗作用,很好的抑制高表达EGFR的肝癌细胞活性。
　　 对于联合治疗来说,选择适当的化疗药物和基因治疗药物十分关键。两种药物必须发挥协同或加强的作用,而不能互相拮抗[4]。本课题选择阿霉素和RRM2 siRNA进行联合治疗,预期能达到良好的治疗肝癌的效果[5,6,7,8]。首先,阿霉素和RRM2 siRNA都能显著抑制DNA合成,抑制细胞增殖[9,10]。另外,阿霉素是治疗肝癌的一线药物[11],而且,阿霉素脂质体已经上市用于肿瘤治疗。虽然,RRM2已经被证实是治疗肿瘤的有效靶点,然而RRM2在肝癌中的研究非常少,目前尚无RRM2 siRNA在肝癌治疗中的研究[12,13]。
　　 对RRM2在肝癌中表达分析发现,所有肝癌细胞的RRM2表达均较高,其中SMMC-7721和HepG2细胞表达最高,Huh7细胞表达最低。通过GEO数据库分析发现,RRM2 mRNA在小鼠肝癌组织中的表达比癌旁组织和正常肝组织增高。在233对人肝癌组织和癌旁组织比较中,96.4％的肝癌组织中RRM2 mRNA表达高于癌旁组织。另外,通过对耐药细胞株中的RRM2分析发现,RRM2高表达可能与肿瘤耐药机制相关。
　　 实验表明ADR可以上调肝癌细胞的RRM2表达。在SMMC-7721细胞中,1μg/mlADR可明显上调RRM2表达,在24h时,RRM2上调幅度最大。在HepG2和Huh7细胞中,ADR同样可以上调RRM2表达。ADR上调肝癌细胞的RRM2表达可能与细胞应激有关系,而上调的RRM2可能会抑制细胞死亡维持细胞的生存。因此,ADR和RRM2 siRNA联合应用可以发挥协同治疗肝癌的效果。
　　 我们发现RRM2 siRNA可以剂量依赖性的抑制RRM2的表达,在200nM,RRM2siRNA能够抑制70-80％的RRM2表达。此外,RRM2 siRNA能显著抑制肝癌细胞增殖,而且RRM2 siRNA可以显著阻滞肝癌细胞的细胞周期中的S期。
　　 利用自组装法我们制备了负载ADR和RRM2 siRNA的脂质体(ADR-RRM2-LPD),体外研究发现,和其他对照组相比,ADR-RRM2-LPD能显著抑制肝癌细胞增殖和诱导p53野生型的HepG2细胞的衰老[14],以及诱导p53突变型的SMMC-7721和Huh7细胞的凋亡。
　　 为了提高ADR-RRM2-LPD的靶向性,我们制备了靶向EGFR的ADR-RRM2-LPD(ADR-RRM2-TLPD)。结果显示,ADR-RRM2-TLPD可以特异性靶向高表达或中表达EGFR的肝癌细胞,而对低表达EGFR的肝癌细胞的靶向性较差。和对照组比,ADR-RRM2-TLPD显示出更强的增殖抑制和凋亡诱导活性。
　　 我们推测ADR-RRM2-TLPD的抗肝癌作用机制在于:ADR-RRM2-TLPD和高表达EGFR的肝癌细胞特异性结合后,内吞便释放ADR和RRM2 siRNA,联合抑制肝癌细胞增殖和转移,促进肝癌细胞的凋亡和衰老[15,16,17]。
　　 综上所述,ADR-RRM2-TLPD是第一个利用EGFR抗体促进内化的负载siRNA和化疗药物的纳米药物。[18,19,20]ADR-RRM2-TLPD能够有效递送ADR和RRM2siRNA,并有效抑制高表达EGFR的HCC细胞活性,它可以作为联合化疗和基因治疗共同治疗HCC的潜在手段。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 RRM2在肝癌中的表达分析

一、实验材料与仪器

1、细胞株

2、主要仪器

3、主要试剂和材料

4、试剂的配方

5、抗体

6、引物序列

7、数据库

二、实验步骤

(一)肝癌细胞中RRM2的mRNA水平表达情况

(二)肝癌细胞中RRM2的蛋白水平表达情况

(三)GEO数据库分析RRM2在肝癌组织中的表达

(四)统计方法

三、实验结果

1、7种肝癌细胞中RRM2在mRNA水平表达情况

2、7种肝癌细胞中RRM2在蛋白水平表达情况

3、小鼠肝癌组织中RRM2高表达

4、人肝癌组织中RRM2表达高于正常肝组织

四、结果讨论

第二部分 ADR-RRM2-LPD体外抗肝癌细胞活性研究

一、实验材料与仪器

1、细胞株

2、主要仪器

3、主要试剂和材料

4、试剂的配方

5、抗体

6、引物(同第一部分)

7、siRNA序列

二、实验步骤

(一)ADR上调肝癌细胞RRM2表达

(二)下调RRM2对肝癌细胞的影响

(三)ADR-RRM2-LPD对肝癌细胞活性的影响

三、实验结果

1、ADR上调肝癌细胞表达RRM2

2、RRM2 siRNA抑制肝癌细胞增殖并阻滞细胞周期的S期

3、ADR-RRM2-LPD抑制肝癌细胞活性

四、结果讨论

第三部分 ADR-RRM2-TLPD体外抗肝癌细胞活性研究

一、实验材料与仪器

1、细胞株

2、主要仪器

3、主要试剂和材料

4、试剂的配方

5、抗体

二、实验步骤

(一)各肝癌细胞表面EGFR表达情况

(二)功能脂质体合成

(三)共聚焦显微镜观察细胞对功能脂质体的内吞

(四)ADR-RRM2-TLPD对肝癌细胞活性的影响

三、实验结果

四、结果讨论

全文小结

参考文献

综述 基因治疗的进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢