MUC1对食管癌细胞生长及其化疗药物治疗食管癌效应的影响

摘要

MUC1粘蛋白(简称MUC1)是一种高分子量Ⅰ型跨膜糖蛋白，它的跨膜序列如棒状插入细胞膜，其主要结构是由多肽骨架和O-糖甘键连接的糖基侧链构成。在正常情况下，主要广泛分布于机体各黏膜表面，包括消化道、呼吸道、乳腺、卵巢、泌尿生殖道等的腺上皮细胞管腔顶端，起到润滑和保护上皮细胞免受外界侵袭作用。
　　食管癌，一种由食管黏膜上皮或腺体发生的恶性肿瘤，目前已成为消化道最常见的恶性肿瘤之一。在本次的研究中我们使用MUC1-siRNA稳定沉默的Ec1.71细胞株观察MUC1对食管癌细胞增殖和侵袭功能的影响，然后使用裸鼠荷瘤模型调查其对体内肿瘤生长的影响和对常规化疗药物5－FU、紫杉醇和顺铂治疗肿瘤作用的影响，并最终初步探讨其可能的机理。为临床上伴有MUCl过表达的食管癌患者的选择性化疗用药或个体化化疗用药提供实验参考。
　　二、研究内容：
　　（一）MUC1靶向小干扰RNA沉默对食管癌Ec1.71细胞的影响
　　1.MUC1稳定沉默细胞株验证。
　　2.MUC1对Ec1.71细胞增殖的影响。
　　3.MUC1对Ec1.71细胞体外成瘤能力的影响。
　　（二）沉默MUC1分子对食管癌裸鼠移植肿瘤的影响
　　1.食管癌Ec1.71细胞移植肿瘤在体内的生长情况。
　　2.对接种在体内的MUC1-siRNA稳定沉默的食管癌Ec1.71细胞中MUC1蛋白表达的影响。
　　3.MUC1分子对食管癌Ec1.71细胞移植瘤生长的影响。
　　（三）MUC1分子对5-氟尿嘧啶和顺铂化疗食管癌效果的影响
　　1.MUC1分子沉默或过表达对种植肿瘤形成的影响。
　　2.5-FU和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤裸鼠体重的影响。
　　3.5-FU和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤体积及体积/体重比率的影响；
　　（四）MUC1分子对紫杉醇和顺铂化疗食管癌效果的影响
　　1.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤裸鼠体重的影响。
　　2.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤体积及体积/体重比率的影响。
　　3.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤增殖调控因子Ki-67及凋亡调控因子Bcl-2表达影响。
　　（五）MUC1分子对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
　　1.MUC1分子对PCNA表达的影响。
　　2.MUC1分子对Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响。
　　3.MUC1分子对细胞色素c释放的影响。
　　4.MUC1分子对caspase-3蛋白的表达影响。
　　三、试验方法：
　　（一）细胞培养：人食管癌细胞Ec1.71在含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中于37℃，5%CO2的条件下培养，细胞培养液隔天更换。
　　（二）载体MUC1-siRNA构建：由上海交通大学医学院细胞分化与凋亡实验室提供。
　　（三）细胞转染：将Ec1.71细胞以浓度为2×105接种于24孔板内培养，细胞融合度达到大于60%是开始准备转染，细胞用无血血清的培养基并加入转染复合物在37℃孵育箱内培养24小时换位正常的细胞培养基；细胞继续培养48小时，观察转染结果。
　　（四）Westernblot:将细胞完全收集，然后提取蛋白、电泳、转膜、封闭蛋白、孵一抗、孵二抗、曝光，以分析细胞中靶蛋白的表达水平。
　　四、结果：
　　（一）MUC1靶向小干扰RNA沉默对食管癌细胞Ec1.71的影响
　　1.MUC1稳定沉默细胞株验证：应用Western blot方法对上海交通大学医学院细胞分化与凋亡实验室提供的MUC1稳定沉默的Ec1.71细胞株内MUC1蛋白的表达程度进行检测，结果显示MUC1分子在Ec1.71细胞内可被完全沉默。
　　2.沉默MUC1的表达可以降低Ec1.71细胞的增殖：利用MTT方法对Ec1.71细胞的的生长能力进行了评估，结果显示Ec1.71/MUC1-siRNA细胞的生长速度与Ec1.71/CTL-siRNA细胞比较出现显著的降低。
　　3.沉默MUC1的表达可以有效的抑制Ec1.71细胞在体外的成瘤能力；利用软琼脂克隆法对MUC1-siRNA沉默MUC1的Ec1.71细胞外肿瘤形成能力进行评价，Ec1.71/MUC1-siRNA细胞克隆形成率的数量和大小显著低于对照组所形成的细胞克隆率。
　　（二）沉默MUC1分子对食管癌裸鼠移植肿瘤的影响
　　1.食管癌Ec1.71细胞能在裸鼠体内正常成瘤：裸鼠在接种到食管癌Ec1.71细胞，第11天接种裸鼠皮下可出现直径约为0.5cm×0.5cm大小的质韧结节，实验结束是荷瘤裸鼠生长状况良好，无一死亡。
　　2.MUC1-siRNA有效的抑制体内接种的Ec1.71细胞内MUC1的表达：使用MUCI-siRNA稳定沉默MUC1分子的Ec1.71细胞在体内的成瘤组织细胞的MUC1蛋白的表达与对照组比较显著降低甚至消失。
　　3.MUC1分子对食管癌肿瘤的生长具有抑制作用：MUC1-siRNA转染的Ec1.71细胞在体内形成的瘤组织显著低于对照组CTL-siRNA转染Ec1.71细胞所形成的瘤组织。
　　（三）MUC1分子对5-氟尿嘧啶和顺铂治疗食管癌效果的影响：
　　1.MUC1分子在体内植肿瘤形成中起到重要作用：MUC1分子沉默后形成的肿瘤大小显著小于MUC1分子过表达时所形成的。
　　2.5-FU和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤裸鼠体重的影响不同：在MUC1稳定沉默组，5-FU可以使裸鼠体重增加；在MUC1过表达组，5-氟尿嘧啶可以使裸鼠体重稍有增加，而顺铂使裸鼠体重显著减少。
　　3.5-FU和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤体积及体积/体重比率的影响不同：在MUC1稳定沉默裸鼠5-FU及顺铂组均未看到明显的肿瘤体积抑制效应；在MUC1过表达裸鼠，观察时间结束时5-FU肿瘤体积抑瘤率为11.7%，顺铂肿瘤体积抑瘤率为32.8%。
　　（四）MUC1分子对紫杉醇和顺铂化疗食管癌效果的影响
　　1.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤裸鼠体重的影响不同：在MUC1稳定沉默组，紫杉醇可以使裸鼠体重稍有增加；在MUC1过表达组，紫杉醇及顺铂都可以使裸鼠体重减少，紫杉醇对裸鼠体重影响小于顺铂。
　　2.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤体积及体积/体重比率的影响不同：在MUC1稳定沉默裸鼠，紫杉醇及顺铂组均未看到明显的肿瘤体积抑制效应；在MUC1过表达裸鼠，观察时间结束时紫杉醇肿瘤体积抑瘤率为23.1%，顺铂肿瘤体积抑瘤率为32.8%。
　　3.紫杉醇和顺铂对MUC1过表达/稳定沉默种植瘤增殖调控因子Ki-67及凋亡调控因子Bcl-2表达影响不同：Ki-67组织染色显示在紫杉醇与顺铂处理组，增殖调控因子Ki-67呈下调趋势；Bcl-2组织染色显示，在紫杉醇与顺铂处理组，凋亡调控因子Bcl-2呈上调趋势。
　　（五）MUC1分子对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响：
　　1.MUC1过表达／稳定沉默对肿瘤组织内PCNA表达的影响不同：在MUC1过表达的肿瘤组织内PCNA表达的阳性细胞数量与MUC1沉默的肿瘤组织中的比较显著提高。
　　2.MUC1过表达／稳定沉默对肿瘤组织内Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达的影响不同：在MUC1过表达的肿瘤组织内Bax蛋白表达的阳性细胞数量与MUC1沉默的肿瘤组织中的显著降低；而在MUC1过表达的肿瘤组织内Bcl-2蛋白表达的阳性细胞数量与MUC1沉默的肿瘤组织中的比较显著提高。
　　3.MUC1过表达／稳定沉默对肿瘤组织内细胞色素c释放的影响不同：在MUC1过表达的肿瘤组织内细胞色素c释放的阳性细胞数量与MUC1沉默的肿瘤组织中的比较显著降低。
　　五、讨论：
　　本次实验我们首先观察MUC1分子稳定沉默后Ec1.71食管癌细胞增殖速度和侵袭能力的影响，接着将MUC1稳定沉默的EC1.71食管癌接种在裸鼠体内检测MUC1分子对体内的生长影响，并与MUC1高表达的C-7食管癌细胞进行对比性研究，观察MUC1蛋白对目前一线的抗肿瘤化疗药物5-FU、紫杉醇和顺铂治疗肿瘤的效果的影响，为临床上食管癌的治疗提供一个初步的用药参考。最后我们将初步探讨MUC1过表达和沉默时对肿瘤细胞增势和凋亡的影响，实验结果显示MUC1分子沉默后食管癌Ec1.71细胞的增势能力和侵袭能力都减弱，将MUC1分子沉默的食管癌Ec1.71细胞接种于裸鼠体内，形成肿瘤的生长情况于体外实验相似，肿瘤组织生长速度与对照组比较显著缓慢。
　　5-FU是细胞周期性特异阻断药物,其功能是抑制DNA的合成，使细胞不能完成肿瘤分裂过程，最终抑制肿瘤的增长，促使细胞发生凋亡；紫杉醇是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，使细胞中止于对放疗敏感的G2和M期；顺铂，通过形成DDP～DNA复合物，干扰DNA复制，细胞阻滞于S期，不能进人G2/M期，增殖受抑，启动细胞凋亡，这些药物对肿瘤的抑制作用基本是通过调节肿瘤细胞增势和凋亡过程来实现的。因此，我们在本次研究中初步探讨了MUC1分子过表达和沉默后对体内肿瘤细胞增殖和凋亡的影响，为其更为深入的机制研究进行一定的理论铺垫，也为临床上食管癌肿瘤的个体化治疗及化疗药物的选择提供了实验参考。

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缩略词表

前言

第一部分MUC1靶向小干扰RNA沉默对食管癌Ec1.71细胞的影响

一、研究背景：

二、材料方法：

三、结 果：

四、讨 论：

第二部分 沉默MUC1分子对食管癌裸鼠移植肿瘤的影响

一、研究背景：

二、材料方法：

三、结 果：

四、讨 论：

第三部分 MUC1分子对5-氟尿嘧啶和顺铂治疗食管癌效果的影响

一、研究背景：

二、材料方法：

三．结果：

四、讨 论：

第四部分 MUC1分子对紫杉醇和顺铂治疗食管癌效果的影响

一、研究背景：

二、材料方法：

三、结 果：

四、讨 论：

第五部分 MUC1 分子对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

一、研究背景：

二、材料方法：

二、结 果：

四、讨 论：

全文总结

参考文献

综述:MUC1与肿瘤形成

在读期间发表论文及参加科研工作情况

附录：1

附录 2:

致 谢