骨髓神经组织定向干细胞源性感觉神经元移植修复周围神经感觉缺损

摘要

临床患者常见的腰部及下肢放射性痛多由腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、腰骶椎不稳定等原因造成的脊神经根受压所致，严重者可以造成患肢的运动功能丧失。椎板开窗、髓核摘除、神经根减压等手术治疗，虽然可以使患者的运动功能及疼痛症状得到缓解，但患肢的麻木等感觉功能障碍却难以恢复，这成为长期困扰临床医生的棘手问题。 神经损伤后感觉功能受损的主要表现是患者的痛觉、温度觉障碍以及继发性的感觉性共济运动失调。此外，感觉神经元构成神经系统反射弧的传入路径，因此还可能造成各种生理性的反射功能丧失等严重后果。如阴部神经的感觉功能缺损，可造成肛门反射异常而引起大便失禁;盆内脏神经的感觉功能缺损，可造成病人膀胱反射消失而引起尿潴留等一系列临床症状。可见，神经损伤后，修复患者的感觉功能，是提高神经修复效果、改善患者生活质量，必须重视的问题。 通过再生医学移植神经干细胞修复神经损伤是公认的有效方法和手段，但目前注意点主要集中在损伤神经的运动功能恢复方面，对感觉功能的恢复缺乏重视。本课题拟通过成体干细胞源性感觉神经元移植，探讨修复感觉缺损的可能性及机制。 通过再生医学移植神经干细胞的方法修复周围感觉神经缺损，首先必须解决移植细胞的种类、来源，和诱导分化为感觉神经元细胞的问题。 骨髓神经组织定向干细胞(neural tissue committed stem cells，NTCSCs)，是骨髓间充质干细胞的一种亚型，或组分，可以自然分化为神经元细胞。NTCSCs可来源于自体、无伦理学争议、避免了免疫排斥反应，并且取材容易，活性好，易于诱导分化，应是较为理想的移植用种子细胞来源。我们实验室前期成功分离、培养了NTCSCs，并诱导分化为神经元样细胞，用于修复周围神经缺损，取得了初步研究成果，但，由于该干细胞存在一定争议，应用研究较少涉及。 Kondo T等通过Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）和成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF2）预诱导，再经音猥因子(sonic hedgehog，SHH)和维甲酸(retinoic acid，RA)的联合诱导，可以将C57小鼠的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)诱导分化为特异性表达VGluT1（Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体）、calretinin（钙结合蛋白）、P2X3（ATP调控的一种离子通道受体）等谷氨酸能感觉神经元特异性标志蛋白的细胞，且可以在脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)存在的微环境中长期存活。这为我们通过骨髓NTCSCs获得大量稳定的可移植用的感觉神经元提供了借鉴依据。 通过移植感觉神经元的方法修复周围神经感觉缺损，还需要找到适宜的周围神经感觉缺损的动物模型。脊神经节内聚集着假单极感觉性神经元，这种感觉神经元负责接收来自躯体和四肢的感觉信息，并进一步传递至中枢神经。背根神经节神经元是一种终末分化神经细胞，一旦死亡，不能再生，从而造成肢体的感觉功能出现异常。Helgren等采用腹腔注射过量吡哆醇的方法导致神经纤维轴索变性及背根神经节神经元的坏死。后续研究证明，通过注射过量吡哆醇制作感觉神经病动物模型的方法简单、操作性强、重复性好，是目前神经科学领域研究感觉神经病的常用模型。 综上所述，本课题拟在成功制备背根神经节病变大鼠动物模型基础上，研究同种异体骨髓NTCSCs源性感觉神经元样细胞移植，修复感觉神经缺损的效果与机制，探讨成体干细胞源性感觉神经元移植，修复感觉神经缺损的可行性，为临床治疗周围神经感觉缺损提供理论和实验依据。 第一部分骨髓NTCSCs源性感觉神经元的分离、培养、诱导分化及鉴定 研究目的:获取移植应用所需的骨髓NTCSCs源性感觉神经元细胞。 材料和方法:从成年SD大鼠骨髓组织中分离获得单个核细胞，采用先贴壁培养筛选、后无血清神经干细胞培养液悬浮培养的方式，分离、扩增出单克隆生长的NTCSCs;对得到的NTCSCs进行鉴定;扩增得到的NTCSCs采用SHH和RA等联合诱导的方法使其向感觉神经元方向分化;对得到的骨髓NTCSCs源性感觉神经元进行鉴定。 结果:SD大鼠骨髓组织中的单个核细胞采用单细胞克隆、无血清悬浮培养得到大量的神经球;神经球细胞表达神经干细胞特异蛋白Nestin和组织定向干细胞特异蛋白CXCR4，同时具有MSCs表型特征:CD29(97.81％)、CD44(91.31％)、CD90(93.85％)、CD105(95.08％)、CD34(3.78％)、CD45(1.59％);超微结构显示多个核仁、丰富的线粒体、常染色质较多等干细胞特征。神经球细胞经SHH和RA联合诱导后表现神经元样细胞外形特征，并且表达NeuN、MAP-2、β-tublinⅢ、GluR-4等蛋白;Gria4、Gria3、Calb2、Pou4f1、Tau、NeuN、MAP-2、TubulinⅢ、NF、GFAP、Neurogenin2等基因表达上调，Nestin、Ret、GATA3等基因表达下调;Tau、MAP-2、NF、NSE、NeuN、Gria4等蛋白表达量增加，Nestin蛋白表达降低。 结论:骨髓组织中存在NTCSCs，可以分离，并能通过细胞球悬浮培养的方法得到大量扩增;NTCSCs在SHH和RA的联合诱导作用下可以分化为具有谷氨酸能特征的感觉神经元样细胞。 第二部分周围神经感觉缺损动物模型的建立 研究目的:建立周围神经感觉缺损动物模型。 材料和方法:成年雌性SD大鼠，体重180-220g，采用早晚两次，连续8天，腹腔注射800mg/kg/d吡哆醇盐酸盐，进行周围神经感觉缺损动物模型的制作。通过动物功能行为学、神经电生理学、受损背根神经节及坐骨神经的组织形态学观察与计量等实验方法，对得到的动物模型进行综合性评价。 结果:造模后动物步态蹒跚、平衡及稳定性较差;足底温度觉和痛觉敏感度降低;坐骨神经感觉潜伏期延长，传导速度降低;背根神经节的神经元萎缩、变性、坏死，神经纤维轴索变性，排列疏松紊乱，伴有髓鞘塌陷、扭曲等。 结论:通过腹腔注射过量吡哆醇的方法可以制作周围神经感觉缺损动物模型。 第三部分骨髓NTCSCs源性感觉神经元移植修复大鼠周围神经感觉缺损的作用与机制 研究目的:探讨骨髓NTCSCs源性感觉神经元样细胞移植修复SD大鼠周围神经感觉缺损的作用与机制。 材料和方法:采用显微注射的方法，将CM-Dil标记的骨髓NTCSCs源性感觉神经元细胞，移植进入吡哆醇诱导的感觉缺损模型动物的L4、L5背根神经节内。分别于移植术后第2周、4周、8周、12周对模型动物进行行为学观察;感觉功能评测;坐骨神经电生理学检测;坐骨神经及背根神经节形态学观察及计量学分析;荧光金(FG)逆行示踪等实验方法与手段，观测移植的感觉神经元对模型动物感觉功能的修复情况。 结果:移植骨髓NTCSCs源性感觉神经元后，模型动物的一般姿势、动作步态随时间的延长出现明显好转的迹象;足底温度觉和痛觉敏感度逐渐恢复;坐骨神经有髓神经纤维计数明显增加，感觉潜伏期缩短、感觉神经传导速度增加，且与时间线性相关;免疫荧光染色CM-Dil标记的骨髓NTCSCs源性感觉神经元在DRG内迁移、定植，并表达NeuN和GluR-4蛋白;DRG内检测到FG标记的神经元细胞数量显著增多。 结论:移植骨髓NTCSCs源性感觉神经元可以有效修复周围神经感觉缺损。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 骨髓NTCSCs源性感觉神经元的分离、培养、诱导分化及鉴定

一、前言

二、材料和方法

(一)试剂和设备

(二)NTCSCs的分离、培养、扩增及鉴定

(三)NTCSCs源性感觉神经元的诱导分化、鉴定

(四)NTCSCs源性感觉神经元的标记

三、结果

(一)NTCSCs的分离、培养、扩增

(二)NTCSCs的鉴定

(三)NTCSCs源性感觉神经元的诱导分化、鉴定

(四)NTCSCs源性感觉神经元的标记

四、讨论

(一)NTCSCs的分离培养与鉴定

(二)NTCSCs源性感觉神经元的诱导分化与鉴定

(三)NTCSCs源性感觉神经元的CM-Dil标记

第二部分 周围神经感觉缺损动物模型的建立

一、前言

二、材料和方法

(一)试剂和设备

(二)感觉缺损动物模型的制作与鉴定

三、结果

(一)模型动物行为学评价

(二)模型动物的感觉功能

(三)模型动物坐骨神经的电生理学评价

(四)背根神经节、坐骨神经的形态学观察与分析

四、讨论

第三部分 骨髓NTCSCs源性感觉神经元移植修复大鼠周围神经感觉缺损的作用与机制

一、前言

二、材料和方法

(一)试剂和设备

(二)实验动物的分组及标记细胞的移植与检测

(三)动物行为学评价

(四)感觉功能测试

(五)坐骨神经的电生理学检测

(六)背根神经节、坐骨神经的再生结构重建的评价

(七)统计学分析

三、结果

(一)动物行为学

(二)动物感觉功能评价

(三)坐骨神经的电生理学评价

(四)背根神经节、坐骨神经的再生结构重建的评价

四、讨论

(一)神经再生的形态学观察

(二)神经再生的电生理学评价

(三)神经再生的行为学及感觉功能评价

全文小结

本课题的创新性

本课题进一步研究工作计划

参考文献

文献综述 骨髓神经组织定向干细胞的研究进展

在读期间发表论文

致谢