携带Ang--1基因的骨髓间充质干细胞对早产儿视网膜病变模型小鼠的干预研究

摘要

早产儿视网膜病变(Retinopathy of premature，ROP)是早产儿比较常见的眼部疾病，主要由于现在医疗水平的提高及围产医学的发展，使早产儿存活率大幅度升高，尤其是对小胎龄儿及低出生体重儿存活率不断增加，使ROP的发生概率也呈现上升趋势。早产儿视网膜病变的机理为视网膜的增生，最终因视网膜纤维组织的增生产生牵拉视网膜组织，最终导致失明的严重后果，因此现成为眼科及新生儿科极其关注的重点，同时引起了众多学者的探索。但其具体发病机制不详。本文章则从ROP存在明显血管增生异常着手，首先应用新生幼鼠构建ROP动物模型，再通过应用转染促血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)基因的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)，在不同的生长时间点输注至模型鼠的体内，通过观察视网膜形态学、HE染色、免疫组化及qRT-PCR方法了解转染携带基因的细胞后，视网膜血管结构形态变化及Ang1的表达情况，主要目的在于讨论携带Ang-1基因的MSCs对于ROP新生血管的影响及作用效果，为以后ROP在细胞治疗方面提供实验依据，从而为临床研究探讨早产儿视网膜病变提供研究支持及基础资料。本实验共分为两个部分。 第一部分:早产儿视网膜病变模型动物的构建 本部分主要选取新生昆明小鼠，雌雄不限制，随机分两组，分别在空气及高氧下饲养，选取生后17日处死，应用改良的明胶墨汁自小鼠心脏灌注，后取材视网膜铺片，观察空气组和高氧组下眼底视网膜血管的增生、变化情况;同时应用Image-proplus6.0处理软件，计算两组视网膜周边血管的生成率，应用SPSS软件，查看其是否有统计学意义;同时取眼球行石蜡包块、切片、HE染色，观察两种情况下视网膜细胞层的形态变化及突出视网膜内界膜新生血管的细胞核数目。综合两点明确该氧诱导ROP动物模型是成功的。 第二部分:携带Ang-1基因的MSCs对小鼠ROP模型的干预及影响 本部分首先是MSCs的复苏、传代培养及冻存过程，在此过程中掌握关于MSCs的基本培育及保存技术，是本实验操作的关键，同时借助于本实验课题组李秋平老师进行的病毒转载Ang-1基因移入MSCs中，并应用DsRed(Red fluorescent protein fromDiscosoma Sp)荧光蛋白技术及单克隆法筛选出转染成功的细胞，后注入模型鼠体内，为下一步干预治疗做准备。并利用(65％±5％)持续吸氧的方法，成功制成小鼠的ROP模型。通过明胶墨汁视网膜灌注观察其形态学、HE染色、免疫组化及qRT-RNA，进一步查看视网膜血管发育变化及Ang-1的表达。研究发现，与空气对照组比较，高氧组视网膜血管走形紊乱，有管腔堵塞所致的无血液充盈区;同时通过HE染色提示高氧组视网膜各层细胞排列均较乱，且有新生血管内皮细胞进入内界膜，差异有统计学意义;在持续高氧环境下，注入Ang-1+MSCs和单纯MSCs不管在视网膜血管形态，还是促进Ang-1表达上均有优化及促进作用，对视网膜异常血管有一定修复功能;且进一步实验数据统计得知，无论从观察视网膜铺片后的形态还是HE染色的，Ang-1+MSCs注入组效果明显好于MSCs组，提示前两者之间在调节血管生成方面有协同作用。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第一部分 高氧诱导新生鼠ROP模型的建立

一、材料与仪器

二、实验方法

三、新生鼠ROP模型的建立效果

四、讨论

参考文献

第二部分 携带Ang-1基因的MSCs对新生ROP模型鼠干预

一、小鼠MSCs的复苏、传代培养与冻存

二、携带Ang-1基因的慢病毒转染小鼠骨髓MSCs细胞

三、小鼠骨髓MSCs的复苏、传代培养及转染基因后的表达情况

四、细胞治疗的动物实验阶段

(一)材料与设备

(二)动物实验方法

(三)检测方法

(四)实验结果

五．讨论

参考文献

文献综述 骨髓间充质干细胞在视网膜病变治疗中的研究现状

在读期间的成果

致谢