NF--kB信号通路基因多态性与乙肝病毒在乙肝相关肝病发生中的作用研究

摘要

背景:乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)慢性感染是我国重大的公共卫生问题，流行病学调查显示大陆地区至少有8亿人感染过乙肝病毒，乙肝表面抗原携带率高达10.34％，占全球慢性感染人数的1/3。乙肝病毒慢性感染可导致肝硬化(livercirrhosis，LC)、肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)等严重的终末期肝脏疾病。HBV核心启动子区(Enhancer(Ⅱ)/BCP/PC)及前S区(preS)的病毒突变、基因型C、高病毒复制水平、e抗原阳性等病毒特征被证明可显著增加肝癌的发病风险。目前乙肝病毒致癌的机制尚未完全明了，有报道认为病毒在宿主基因组上的整合可增加染色体不稳定性，是病毒致癌的重要机制之一。肝癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是人体重要的遗传标志，在基因组内广泛分布，可影响人群对疾病的易感性。NF-κB是引起炎症反应的关键转录因子，可调节超过200个基因的表达，包括各种细胞因子、趋化因子及黏附分子等，在机体抵御外界因素侵犯及炎症-癌症转换中发挥至关重要的作用。因此研究NF-κB信号通路的遗传多态性和乙肝病毒因素在乙肝相关肝病中的作用对明确乙肝病毒致病机制具有重大的意义。 目的:分析NF-κBSNP(rs696，rs2233406，rs3138053，rs28362491)与乙肝病毒慢性感染、病毒清除、乙肝后肝硬化及肝癌发生风险的相关性，并分析这些SNP位点和乙肝病毒突变频率的关系及两者在乙肝后肝硬化、肝癌发生中的交互作用。分析乙肝病毒整合在复发性HCC病人及长期未复发HCC病人中的特点，找到和肝癌发生及复发相关的高频整合位点。 方法:采用荧光探针-实时定量PCR法对1342例健康对照、327例乙肝病毒自然清除者、316例无症状携带者、866例慢乙肝患者、482例肝硬化患者以及1182例乙肝后肝癌患者进行SNP分型，用型特异性引物多重PCR法对HBV基因型进行鉴定，用巢式PCR法对HBV基因组的EnhⅡ/BCP/PC和preS区进行扩增，测序后使用MEGA5.0进行序列比对鉴定病毒突变。采用非条件logistic回归法分析SNP与病毒突变在终末期肝病中的相乘性交互作用。采用HBV捕获测序检测36例复发性HCC病人及14例长期未复发HCC病人的配对癌及癌旁组织中的病毒整合情况，用student'st检验或卡方检验比较整合事件和临床资料的关联，并用生物信息学分析对整合基因进行注释，找到高频整合位点。 结果: 1、NF-κBSNP与乙肝相关肝病的关系 (1)NF-κBSNP和乙肝病毒慢性感染及病毒清除的关系 在校正了年龄和性别因素后，rs28362491del/del基因型相对于ins/ins基因型来说显著降低了健康人群患基因型B乙肝病毒慢性感染的风险(AOR=0.58，95％CI=0.37-0.91，P=0.019)。当乙肝病毒自然清除者作为对照时，rs2233406的CT基因型、rs3138053的AG基因型及显性模型(AG+GG)显著降低了基因型B乙肝病毒慢性感染的风险（rs2233406CT:AOR=0.63，95％CI=0.39-0.99，P=0.047;rs3138053AG:AOR=0.56,95％CI=0.35-0.90,P=0.016;rs3138053AG+GG:AOR=0.54,95％CI=0.34-0.86，P=0.010）。同时，rs3138053的显性模型还可显著降低基因型C乙肝病毒慢性感染的风险（AOR=0.71，95％CI=0.50-1.00，P=0.048）。rs696未表现出和乙肝病毒慢性感染或清除的相关性。 (2)NF-κBSNP和终末期肝病发生发展的关系 在分析NF-κBSNP和肝硬化及肝癌发生相关性时，我们发现这4个位点和肝硬化的发生均无显著相关性。而在基因型CHBV分层人群中，发现在校正年龄和性别后，rs2233406的CT基因型及显性模型(CT+TT)不仅显著增加健康人群发生乙肝后肝癌的风险(CT:AOR=1.35，95％CI=1.06-1.71，P=0.014;CT+TT:AOR=1.31，95％CI=1.04-1.65，P=0.021)，CT基因型还可显著增加慢乙肝患者进展为肝癌的风险（AOR=1.33，95％CI=1.01-1.75，P=0.043）。其他3个位点和肝癌的发生无相关。 2、NF-κBSNP和HBV突变的关系及两者在肝癌中的交互作用 (1)NF-κBSNP和HBV突变的关系 在基因型C感染者中，多因素分析显示在校正了年龄和性别后，rs2233406的突变基因型可显著增加T1753V,A1762T/G1764A，G1719T,preSdeletion，preS1startcodonmutation（均为肝癌危险性突变）的频率。rs28362491的突变基因型在C型感染者中可显著增加A1762T/G1764A（肝癌危险性突变）的频率，同时降低preS2startcodonmutation（肝癌危险性突变）的频率。在基因型B感染者中，rs28362491的del/del基因型可显著增加G1899A（肝癌危险性突变）的频率。rs696及rs3138053两个SNP位点在基因型B和C感染者中均未显示出和病毒突变频率有关联。 (2)NF-κBSNP和HBV突变在乙肝后肝癌发生中的交互作用 在基因型C感染者中，经过年龄和性别的校正，rs2233406的显性模型(CT+TT)和A1762T/G1764A在慢乙肝进展为肝癌的过程中存在显著的协同性交互作用（AOR=2.61，95％CI=1.09-6.26，P=0.032），两者共同促进肝癌的发生。同时，rs2233406的显性模型(CT+TT)还和preS2startcodonmutation在基因型C肝癌的发生中存在显著的拮抗性交互作用(AOR=0.42，95％CI=0.19-0.93，P=0.032)，降低了肝癌的发生风险。 3、病毒整合率及整合数与临床资料的关联 乙肝后肝癌病人癌组织中病毒整合率为80％，显著高于癌旁组织中病毒的整合率44％（P＜0.001），而复发和未复发HCC病人相比病毒整合率无显著差异。复发性HCC病人癌组织中病毒的平均整合数为2.78个，显著高于未复发HCC病人癌组织中的平均整合数1.21个（P=0.002）。晚期复发HCC病人癌组织中的平均整合数为2.6个，显著高于癌旁组织中的平均整合数0.53个（P=0.002），而早期复发和长期未复发组癌和癌旁中的平均整合数无显著差异。病毒整合数还和HCC病人性别显著相关，男性癌组织中的平均整合数为2.59个，显著高于女性癌组织中的平均整合数0.50个(P=0.028)。 4、整合位点在人和病毒基因组上的分布 HBV在癌组织中的整合更趋向于启动子区和外显子区等功能区域，而在癌旁组织中则大都分布于内含子或基因间区。5号染色体是复发性癌组织整合的高频位点，而2号染色体是所有癌旁组织的高频整合位点，14、17、18及Y染色体上的整合仅见于癌组织而未见于癌旁组织。在复发和未复发HCC病人的癌或者癌旁组织中，HBV整合位点均集中于1600-1900bp之间。 5、整合基因的功能注释及高频整合位点 病毒整合的基因间存在相互作用的复杂关系，癌旁组织中的整合基因大多与调节基因转录有关，未复发癌组织中的整合基因与端粒酶的活性相关，而复发性癌组织中的整合基因主要参与细胞凋亡和染色质重塑。除TERT、FN1及MLL4基因外，发现了8个新的HBV高频整合位点。 结论: 1、rs28362491del/del基因型可降低健康人群患基因型BHBV慢性感染的风险;rs3138053的G等位基因可同时增加基因型B和CHBV的清除;rs2233406的CT基因型可增加基因型BHBV的清除，同时增加健康人及慢乙肝患者发生基因型C肝癌的风险。 2、NF-κBSNP可影响HBV突变频率，两者在肝癌的发生中存在复杂的交互作用。 3、相对于癌旁组织，HBV在HCC癌组织中的整合更为常见;病毒整合在肝癌复发的过程中得到了富集，且癌旁组织中的整合数越高，肝癌术后复发越早。 4、HBV在HCC癌和癌旁组织中的整合模式不同，在癌组织中的整合可能和肝癌发生的关系更加密切。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词表

前言

第一部分 基因多态性与病毒突变在终未期肝病中的交互作用研究

一、实验材料

二、研究方案

三、实验结果

四、分析与讨论

第二部分 乙肝病毒整合在肝癌发生及复发中的作用研究

一、实验材料

二、研究方案

三、实验结果

四、分析与讨论

结论与意义

参考文献

附录

综述 乙肝病毒及宿主单核苷酸多态性与肝癌发生的研究进展

在读期间发表论文和科研工作情况

致谢