柴胡皂苷d对大鼠肝星状细胞HSC--T6的增殖活化及雌激素受体表达的影响

摘要

研究背景和目的： 肝纤维化是指肝纤维结缔组织的过度沉积以及细胞外基质合成和降解的不平衡的结果，是各种慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展所共有的病理改变和必经途经。肝星状细胞是细胞外基质产生的主要细胞来源，生理状态下主要维持肝脏正常生理功能，病理状态下肝组织释放多种细胞因子、脂质过氧化物、炎症因子等刺激肝星状细胞活化，合成大量细胞外基质，在肝纤维化发生发展过程中起重要作用，研究表明多种信号转导通路在上述过程中也起到关键作用，主要有MAPK和TGF-β/Smad信号通路。雌激素作为一类具有广泛生物活性的甾体类激素在临床上、动物水平及细胞水平实验中已被证实具有抗肝纤维化、抑制细胞外基质沉积的作用。但由于其副作用多，限制其在临床上广泛运用。近些年研究发现，植物雌激素在治疗肝纤维化方面被证实有较好的疗效，而且安全、副作用小，为未来临床上治疗肝纤维化药物选择提供新的选择。《神农本草经》记载，柴胡是伞形科草本植物，以根入药，其性味苦凉、微寒、归肝胆实经，具有和解表里、舒肝利胆、退热升阳等作用，而柴胡皂苷是其主要的生物活性成份，柴胡皂苷药理活性最强的是柴胡皂苷d(SSd)，SSd已被证实在体内外有弱雌激素样作用，属于植物类雌激素。但其是否能通过雌激素受体作用于肝星状细胞至今尚未明确。因此本实验旨在研究SSd对大鼠肝星状细胞系HSC-T6细胞增殖与细胞周期分布和雌激素受体表达的影响，以及在氧化应激条件下对细胞外基质合成降解，活性氧产生，MAPK信号通路的影响。 研究方法： HSC-T6细胞用含有5％sFBS的无酚红DMEM培养基接种于细胞培养板。用不同浓度的SSd和E2处理细胞，筛选最佳用药浓度。用SSd(5μM)和E2(1μM)处理细胞不同时间，筛选最佳用药时间。用DMSO、SSd（5μM）、E2（1μM）加或不加雌激素受体完全拮抗剂ICI182.780（1μM）处理细胞24小时，氧化应激条件在此后加入H2O2处理4h。用MTT法检测细胞增殖情况，荧光素酶报告基因检测ER通路激活情况，流式细胞术检测细胞周期分布和细胞内ROS含量变化，免疫组化检测α-SMA的表达，ELISA法检测TGFβ1、Hyp、TIMP-1、MMP-1、MDA、SOD的含量变化，RT-PCR检测ERα/β mRNA表达，Western blot法检测ERα/β蛋白表达，MAPK信号通路激活情况。 研究结果： 1.SSd和E2能够抑制HSC-T6细胞的增殖，使S期细胞减少，使细胞周期阻滞于G0/G1期。诱导HSC-T6细胞中ER特异报告基因表达，上调HSC-T6细胞内ERα/β蛋白和mRNA的表达，且都呈时间和剂量依赖性。 2.SSd和E2能够抑制氧化应激诱导的HSC-T6细胞的增殖与活化，降低a-SMA的表达;通过抑制TGFβ1和Hyp的表达，抑制TIMP-1的活性，促进MMP-1的活性来抑制ECM的合成，并促进其降解。SSd和E2可以减少MDA和ROS的产生，增强Cu Zn-SOD的活性，这种抗氧化应激作用可能是其抑制HSC活化及ECM的合成降解的机制之一。SSd和E2能够抑制MAPK信号通路(ERK、JNK、p38)的激活，这种效应可能是其抗氧化应激及抑制肝纤维化的分子机制之一。 3.上述效应均可以被ER完全拮抗剂所阻断，提示SSd可能是通过ER来达到上述效应。 结论： SSd可以通过ER抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖与活化，减少ECM的沉积，其机制可能是通过抗氧化应激，抑制TGFβ1/MAPK信号通路来实现的。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 柴胡皂苷-d对HSC-T6细胞增殖及雌激素受体表达的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 SSd对氧化应激诱导的大鼠肝星状细胞HSC-T6活化的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

结论

参考文献

综述 肝纤维化与活化肝星状细胞的清除

在读期间参与发表的论文及参加的科研工作

致谢