PEG--mCeramide修饰的阿霉素脂质体的制备及其抗肿瘤作用

摘要

多药耐药(MDR)，是肿瘤细胞对多种化疗药物耐药的一种常见的耐药形式，也是导致肿瘤化疗失败和肿瘤复发的重要原因，成为当前研究肿瘤治疗的热点话题。纳米技术应用于临床制药是化疗研究的一项重大突破，而且利用纳米技术克服肿瘤细胞耐药引起了广泛关注。本文结合了肿瘤耐药细胞的自身代谢特点，采用乙醇注入法制备PEG-mCeramide修饰的脂质体，以硫酸铵梯度法包裹阿霉素，得到PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体（Lipo-ADR-Cer-）。本项研究展示了，Lipo-ADR-Cer-能够降低肿瘤耐药细胞对阿霉素的IC50，体外明显抑制肿瘤耐药细胞MCF-7-ADR和HL-60-ADR的细胞活性，体内具备强的抗肿瘤效果。 通过检测糖基化ceramide合酶(GCS)在乳腺癌和白血病细胞株中的表达发现，在MCF-7-ADR和HL-60-ADR细胞株上GCS的表达均比MCF-7和HL-60敏感肿瘤细胞株增多。我们考虑GCS的过表达与肿瘤细胞的耐药相关，这些实验结果为利用外源性的ceramide来克服肿瘤耐药增加可能。同时，体外游离药物细胞杀伤实验表明PEG-mCeramide比对照PEG-DSPE的细胞毒性明显增强，不同浓度的游离的PEG-mCeramide与游离阿霉素联合给药有增敏效果，增敏指数随着PEG-mCeramide浓度的增高而不断增加，而且我们发现在耐药细胞株上，低剂量的PEG-mCeramide联合阿霉素的增敏效果比敏感细胞强。 本课题中我们采用乙醇注入法制备PEG-mCeramide修饰的空白脂质体和无修饰的对照空白脂质体，以硫酸铵梯度法包裹化疗药物阿霉素，制备PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体(Lipo-ADR-Cer-)和对照阿霉素脂质体(Lipo-ADR-)。对纳米脂质体的粒径、Zeta电位、载药量，包封率等基本表征进行检测，结果表明两种阿霉素脂质体的基本表征无明显差异，而且两种阿霉素脂质体的不同PH条件下的体外释放实验结果亦无明显差异。我们通过cck8法检测Lipo-ADR-Cer-、Lipo-ADR、游离ADR和游离ADR+PEG-mCeramide在不同给药时间点对MCF-7、MCF-7-ADR、HL-60和HL-60-ADR细胞株的体外杀伤效果，结果展示了在两株敏感肿瘤细胞株（MCF-7和HL-60）上，Lipo-ADR-Cer-和Lipo-ADR-的杀伤效果无统计学差异，而在两株耐药的肿瘤细胞株(MCF-7-ADR和HL-60-ADR)上，Lipo-ADR-Cer-的杀伤效果明显强于Lipo-ADR-。为探讨Lipo-ADR-Cer-杀伤效果增强的机制，我们利用流式细胞术和共聚焦显微镜技术对比了两种脂质体在细胞转染和内吞的差异，结果显示两者均无统计学差异。故我们考虑Lipo-ADR-Cer-杀伤效果增强的机制在于耐药细胞自身的代谢特点。 在体内实验中，我们构建了乳腺癌腋下负荷裸鼠的动物模型和白血病裸鼠动物模型，通过系统观察了肿瘤小鼠的体重变化和肿瘤大小，定期定量对小鼠尾静脉注射Lipo-ADR-Cer-、Lipo-ADR-、游离ADR和游离ADR+PEG-mCeramide以及PBS后，评价乳腺癌小鼠的体内肿瘤抑制效果和白血病小鼠的生存状况。体内抗肿瘤实验表明，在两种肿瘤细胞的动物模型上，PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体组的体内抗肿瘤效果比对照阿霉素脂质体组的效果强，游离的阿霉素联合PEG-mCeramide体内抗肿瘤效果比游离阿霉素组的效果强，但两组游离药物组的治疗效果均不及两组纳米药物组，而且游离阿霉素组与PBS组的效果相近。 结论:与敏感的肿瘤细胞株相比，GCS在耐药肿瘤细胞株上的表达增多;对比对照阿霉素脂质体，PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体的基本表征、体外释放过程、体外转染效率以及细胞的内吞过程均无统计学差异;在耐药细胞株上，对比对照阿霉素脂质体，PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体的体外杀伤效果和体内抗肿瘤效果增强。本课题结合肿瘤耐药细胞的自身特点，利用具有杀伤效应PEG-mCeramide修饰纳米脂质体载体，制备PEG-mCeramide修饰的阿霉素脂质体，为探讨克服肿瘤细胞耐药提供了新的证据，为治疗MDR提供了一条新的途径。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 GCS的表达和游离药物的体外细胞毒性研究

一、实验材料和仪器

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第二部分 阿霉素脂质体的制备、基本表征和体外释放

一、实验仪器和材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第三部分 阿霉素脂质体的细胞毒性、内吞和转染效率

一、实验仪器和材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

第四部分 体内抗肿瘤实验

一、实验仪器和材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与结果讨论

全文小结

参考文献

综述 鞘脂类在肿瘤研究中的进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢