一氧化氮介导阻塞性黄疸alpha肾上腺素能血管低反应性的机制及代谢组学研究

摘要

阻塞性黄疸血管低反应性是其并发症发生和死亡率增高的一个主要机制。临床对血管活性药物治疗的反应减弱或不反应，也与血管低反应性有关，且严重影响着治疗效果。其产生原因可部分解释为血清前列腺素产生增加、牛胆酸钠水平增加、内毒素血症、NO过量产生、内源性阿片肽水平增加。阻塞性黄疸血管肾上腺素能低反应性的发生可能与血管α1-肾上腺素能受体活性缺失有关，α2-肾上腺素能受体的脱敏作用也可能在胆汁淤积时发生。目前尚没有检索到国内外有关阻塞性黄疸α-肾上腺素受体血管低反应性发生机制的临床研究报道。近年来，许多研究证实，阻塞性黄疸可导致体内NO合成增多，有证据表明NO在胆汁淤积引发的血管低反应性中起作用。
　　本研究首先选取了胆道和胰头部肿瘤引起的胆汁淤积性黄疸患者，ASAⅠ～Ⅱ级，另外，选取ASAⅠ～Ⅱ级，年龄、性别、体重等一般情况相似的非黄疸患者（原发性肝癌或肝血管瘤等）作为对照组。在手术开始前，利用Swan-ganz导管等测定基线MAP、HR、CI、SVR和SVRI后，持续输注递增浓度的去甲肾上腺素5min（30、60ng.kg-1 min-1，PE、Dex方法类似，PE浓度为160、320ng.kg-1min-1，Dex浓度为0.5、1、2ug kg-1h-1），并重复测量血流动力学数据。在入室后评估血管反应性之前收集静脉血样本。
　　其次在Sprague Dawley雄性大鼠采用离体血管功能实验探讨了一氧化氮对血管低反应性发生机制的影响。首先探讨了内皮、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME对血管收缩反应的影响，然后根据结果利用硝普钠作为一氧化氮供体探讨了一氧化氮引起阻塞性黄疸血管舒张的机制。首先分别用选择性鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ、非选择性K+通道阻断剂四乙铵TEA（非选择性IKca通道阻断剂），BKCa的特异性阻断剂iberiotoxin及卡律蝎毒素charybdotoxin，和格列本脲(KATP通道阻断剂)，4-氨基吡啶4-AP（电压门控K+通道阻断剂）和氯化钡（Kir通道阻断剂）培育30min，然后加入PE达到最大收缩幅度。随后得到SNP（10-9至10-6mol/L）的累积浓度-反应曲线。
　　为探讨血清中与血管低反应性有关的代谢物，SD雄性大鼠16只，随机分为胆总管结扎组(n=8)和假手术对照组(n=8)。手术后3天收集血清使用反相色谱与亲水色谱(HILIC)联合四级杆飞行时间串联质谱(Q-TOF MS)的方法进行代谢组学分析。并依据代谢组学所提示结果检测血清中丙二醛(MDA)、总抗氧化力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、氧化谷胱甘肽(GSSG)和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性来评估氧化应激状态。
　　主要研究结果如下:
　　1.临床研究
　　(1)在NA60ng.kg-1min-1持续泵注5min后，黄疸患者MAP增加值显著低于非黄疸患者（14.77±6.37mmHg VS18.12±7.35mmHg，p＜0.05），黄疸组和非黄疸组SVR、SVRI均显著增加，但其增加值两组间均没有统计学差异(SVR205.23±102.65 dyn.s.cm-5m2 VS281.47±182.58 dyn.s.cm-5m2,p＞0.05;SVRI为326.14±165.99 dyn.s.cm-5m2 VS434.00±300.23 dyn.s.cm-5m2, p＞0.05)。两组患者给予两种不同剂量的NA时CI值均没有显著的改变。
　　(2)在去氧肾上腺素320ng.kg-1min-1持续泵注5min后阻塞性黄疸患者MAP、SVR、SVRI增加值显著低于非黄疸组患者（10.11±7.10mmHg VS16.78±5.71mmHg，p＜0.05;SVR123.67±99.18 dyn.s.cm-5m2 VS211.83±91.98 dyn.s.cm-5m2,p＜0.05;SVRI206.50±159.67 dyn.s.cm-5m2 VS369.83±168.92dyn.s.cm-5m2，p＜0.05)。两组患者给予两种不同剂量的PE时CI值均没有显著的改变。
　　(3)7例非黄疸组患者在Dex0.5ug.kg-1h-1持续泵注5min后，平均动脉压(MAP)升高心指数(CI)显著增加，外周血管阻力(SVR)、外周血管阻力指数(SVRI)显著下降。在Dex2μg.kg-1h-1持续泵注5min后阻塞性黄疸患者MAP、SVR、SVRI增加值均显著低于非黄疸组患者（MAP8.13±5.80mmHg VS11.83±4.44mmHg,p＜0.05; SVR115.94±132.19 dyn.s.cm-5m2 VS244.70±171.58 dyn.s.cm-5m2, p＜0.05;SVRI192.53±206.94 dyn.s.cm-5m2 VS413.00±287.96dyn.s.cm-5m2,p＜0.01）。两组患者CI值仅在非黄疸患者给予Dex2μg.kg-1h-1持续泵注5min与基线值相比显著降低，从3.32±0.53L/min.m2降至3.15±0.61 L/min.m2(p＜0.01)。
　　2.离体实验
　　(1) SD大鼠胆道结扎3天后对去甲肾上腺素的血管收缩反应明显减弱，去除内皮或使用L-NAME孵育后血管反应性明显恢复。
　　(2)胆道结扎7天与假手术7天组大鼠胸主动脉对SNP的舒张反应没有明显差异，使用ODQ孵育后两组舒张反应基本消失;TEA、iberiotoxin及charybdotoxin孵育后BDL、sham组舒张反应均有所减弱，TEA、charybdotoxin孵育后sham7天组大鼠离体胸主动脉环对累积浓度的SNP的舒张反应明显减弱;4-AP、Bacl2孵育后舒张反应无明显变化;Gly孵育后舒张反应均有所增强，其中假手术组有显著差异。
　　3.代谢组学:胆道结扎3天后主要改变包括L-苯丙氨酸，L-谷氨酸，L-酪氨酸，犬尿氨酸，L-乳酸，溶血磷脂酰胆碱(LysoPCc(14∶0))，甘氨酸和琥珀酸水平升高，L-缬氨酸，磷脂酰胆碱PCb(19∶0/0∶0)，牛磺酸，棕榈酸，L-异亮氨酸和柠檬酸代谢产物降低。胆道结扎后GSH，T-AOC降低，SOD，GSH-Px活性下降，MDA水平上升。
　　结论:
　　1.阻塞性黄疸患者alpha-1、alpha-2B肾上腺素受体敏感性明显减弱，可能部分归因于阻力血管反应性降低。alpha-2A肾上腺素受体激动可能对血压影响小，心功能增强，外周血管阻力下降。
　　2.内皮相关的NO在阻塞性黄疸血管低反应性中起主要作用，NO主要通过非KCa通道引起BDL大鼠胸主动脉舒张。
　　3.阻塞性黄疸大鼠存在广泛的氧化应激，犬尿氨酸水平升高。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、阻塞性黄疸血流动力学危害及其研究进展

二、阻塞性黄疸血管低反应性前期研究及研究意义

三、阻塞性黄疸血管低反应性肾上腺素能相关机制

四、本课题的研究方向

参考文献

第一部分 阻塞性黄疸患者对alpha肾上腺素受体激动剂的反应性受损：alpha-AR亚型及NO的作用

一、对象和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 一氧化氮通过非Kca途径引起阻塞性黄疸大鼠离体胸主动脉舒张

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分 阻塞性黄疸大鼠模型代谢组学揭示氧化应激和犬尿氨酸可能参与了血管低反应性的发生

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

参考文献

综述 阻塞性黄疸血管低反应性研究进展

博士在读期间发表文章和参与的工作

致谢