LAG3参与小鼠急性肺损伤炎症消退及其可能机制研究

摘要

目的： 急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征的急性呼吸衰竭综合征。脓毒症是急性呼吸窘迫综合征的常见病因。目前ARDS的主要治疗方式为肺保护性通气策略、ECCO及相关对症治疗，治疗效果欠佳。 炎症是机体抵御病原微生物和组织损伤有效的宿主防御手段。在炎症刺激的作用下，机体激活大量的炎症细胞中和或清除致病因子，从而恢复内环境稳态。炎症消退是从炎症激活状态恢复到稳态的主动的程序化过程。有关炎症消退的调控机制广为接受的是巨噬细胞及其分泌的种类多样的促炎症消退介质。近年来多项研究逐渐揭示，CD4+CD25+Treg也是促进急性肺损伤炎症消退的重要因素之一。CD4+CD25+Treg除了广为熟悉的淋巴细胞的免疫抑制作用外，还通过非TCR依赖的方式促进组织修复。 淋巴细胞活化基因3分子（lymphocyte activation gene3，LAG3，CD223）是免疫球蛋白超家族的一员，已有研究表明LAG3分子与CTLA-4和PD-1相似，作为负性共刺激分子，其激活可负向调控淋巴细胞功能。同时也有研究表明，LAG3是CD4+CD25+Treg抑制性功能最大化的必要条件。 LAG3分子在急性肺损伤炎症消退中扮演何种作用，干预LAG3分子的表达水平能否影响急性肺损伤炎症消退，目前尚未见报道。为此，本实验拟以LPS气管内注射诱导的急性肺损伤为动物模型，观察病程全程小鼠肺内不同免疫细胞的计数及LAG3分子在各种淋巴细胞上的表达变化；并探讨LAG3基因敲除是否影响小鼠急性肺损伤炎症消退进程，并以此探索急性肺损伤中炎症消退延迟的治疗合理可靠的免疫靶点。 方法： 1、采用LPS气管内注射诱导的急性肺损伤模型，建模前及建模后10d测量小鼠体重，评估急性肺损伤在建模后不同时间点炎症消退的动态变化。 2、采用LPS气管内注射致急性肺损伤模型，将28只C57BL/6小鼠随机分为假手术组（n=4）、LPS1d组（n=6）、LPS4d组（n=6）、LPS7d组（n=6）及LPS10d组（n=6），取肺组织，HE染色检测病理改变，并进行肺损伤评分，评估急性肺损伤在建模后不同时间点炎症消退的动态变化；取肺泡灌洗液和肺组织，流式细胞仪检测急性肺损伤小鼠建模后不同时间点肺泡灌洗液和肺组织中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞、CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（regulatory T cells，Treg）、树突状细胞（dendritic cell，DC）的计数动态变化，以及CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞、DC细胞和CD4+CD25+调节性T淋巴细胞上的LAG3表达水平。 3、利用LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，随机分为假手术组（n=4）及LPS组（n=6），建模术前及术后10d每天记录每只小鼠体重变化。 4、利用LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，各28只。组内在随机分为假手术组（n=4）、LPS1d组（n=6）、LPS4d组（n=6）、LPS7d组（n=6）及LPS10d组（n=6）。56只小鼠分两批同时建模，取肺组织行病理切片染色观察及肺损伤病理评分；取肺泡灌洗液，检测中性粒细胞计数及总蛋白含量；检测CD4+CD25+Treg的计数。 结果： 1、假手术组10d内体重略有增加，无统计学意义。LPS组体重1d下降；4d降至最低，与1d相比有统计学意义；7d体重明显下降，10d基本恢复正常。 2、假手术组在各个时间点均无明显肺组织病理学改变。LPS组的肺组织病理损伤评分1d最高；4d稍有下降，与1d相比无统计学意义；7d评分明显下降，10d基本恢复正常。 3、急性肺损伤术后，小鼠肺泡灌洗液中CD11b+Ly6g+中性粒细胞、CD11C+MHCⅡ+CD11b+DC、NK1.1+NK细胞的计数1d升高、4d达到高峰，7d下降（P值均小于0.05）；小鼠肺泡灌洗液中CD4+T淋巴细胞、CD4+CD25+Treg4d开始出现升高、7d达到高峰,，10d仍未见明显下降（P值均小于0.05）；小鼠肺泡灌洗液中CD8+T淋巴细胞、CD19+B细胞及DC细胞数量未见明显变化。小鼠肺组织中各类免疫细胞的变化与肺泡灌洗液中的变化类似。 4、急性肺损伤术后，小鼠肺泡灌洗液及肺组织中CD4+T细胞及CD4+CD25+Treg细胞表面的LAG3表达呈现出相似的变化趋势，4d开始出现升高、7d达到高峰（P值均小于0.05）。CD8+T细胞及CD19+B细胞上的LAG3表达水平未见明显变化。 5、利用LAG3基因敲除小鼠（LAG3KO）及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠术后1d体重出现降低，4d降至最低，此后出现回升。与野生型小鼠相比，LAG3KO小鼠术后7d体重回升小，10d仍未恢复至术前水平（P值均小于0.05）。LAG3KO小鼠及野生型小鼠间比较，1d及4d的体重未见统计学差异；建模后1d和4d，LAG3KO小鼠及野生型小鼠肺损伤病理评分无差异。建模后7d及10d，LAG3基因敲除小鼠病理损伤评分均高于野生型小鼠（P值均小于0.01）。 6、利用LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，建模后1d和4d，LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数无差异。建模后7d及10d，LAG3基因敲除小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数均高于野生型小鼠（P值均小于0.01）。 7、利用LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，建模后1d和4d，LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠肺泡灌洗液总蛋白含量无差异。建模后7d及10d，LAG3基因敲除小鼠肺泡灌洗液总蛋白含量均高于野生型小鼠（P值均小于0.01）。 8、利用LAG3基因敲除小鼠及野生型小鼠建立急性肺损伤模型，结果提示7d及10d这两个时间点，LAG3基因敲除小鼠Treg数量较野生型小鼠显著下调，有统计学意义（P值均小于0.01）。在1d和4d这两个时间点，两种小鼠间比较无统计学差异。 结论： 本模型急性肺损伤在1d-4d为肺部炎症的急性期，7d-10d为炎症消退期。肺内各类免疫细胞数量的动态改变提示中性粒细胞、DC细胞、NK细胞主要作用于肺损伤炎症急性期，CD4+T细胞、CD4+CD25+Treg细胞及巨噬细胞主要作用于肺损伤炎症消退期。其中CD4+CD25+Treg的数量在急性肺损伤炎症消退期出现增多且LAG3在CD4+CD25+Treg上的表达在炎症消退期也出现上调。LAG3基因敲除小鼠急性肺损伤炎症消退出现延迟，提示LAG3参与调控急性肺损伤炎症消退，可能与LAG3对CD4+CD25+Treg的功能调控有关。

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