去泛素化酶USP33在去势抵抗性前列腺癌中的作用及机制研究

摘要

目的:前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，在欧美国家男性肿瘤发病率常年排名首位。近几年，我国男性前列腺癌发病率也快速增长，成为备受关注的一种恶性肿瘤。目前，前列腺癌的主要的治疗方案包括手术治疗、放射治疗及内分泌治疗等。对于晚期前列腺癌来说，内分泌治疗是主要的治疗方法。然而，当经过一定时间内分泌治疗后，大部分患者会面临肿瘤的复发，逐渐转变为去势抵抗性前列腺癌(Castrationresistant prostate cancer，CRPC)。一旦进入该期，针对前列腺癌的治疗大多无效。因此，CRPC的治疗成为临床治疗的难点及前列腺癌研究的热点。泛素化修饰(Ubiquitinmodification)，是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰(Post-Translational Modification)，它能够通过对特定底物蛋白进行泛素化修饰从而影响底物蛋白的降解、活化或细胞内定位的改变。因此，它在细胞的正常生理活动中发挥不可缺少的作用。但当它的功能出现异常，也可能导致细胞功能紊乱进而导致疾病包括肿瘤的发生。已有大量研究表明，泛素化修饰在肿瘤的发生、发展过程中发挥着非常重要的作用。去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)是泛素化修饰过程中一种能逆转泛素化修饰的关键酶，它在肿瘤进展过程中的新功能、新机制也一直是肿瘤研究中的重点。既往研究报道显示去泛素化酶USP33(Ubiquitin specific protease33)在雄激素刺激前列腺癌细胞后的表达量有明显升高，因此认为它可能在前列腺癌生长中发挥一定作用，遂本课题的研究目的是探讨USP33在前列腺癌（尤其是去势抵抗性前列腺癌）中的作用及机制。
　　方法:培养前列腺各细胞系，包括RWPE，LnCap，PC3，DU145，LnCap-AI，C4-2,22RV1。采用RT-PCR方法检测USP33在各细胞系中的表达量，通过免疫组化检测USP33在前列腺癌组织及前列腺增生组织中的表达量并比较其差异。采用流式技术检测USP33对PC3细胞凋亡的影响。通过CCK8及Transwell实验分别检测USP33对前列腺细胞的生长、迁移及侵袭能力的影响。用免疫共沉淀及质谱分析寻找与USP33相结合的靶蛋白，通过western blotting验证USP33与靶蛋白的结合，并研究其对靶蛋白的修饰方式分析及作用通路。建立裸鼠的皮下荷瘤模型及瘤内注射干扰RNA的治疗模型。
　　结果:本研究发现USP33在前列腺癌尤其是雄激素非依赖(Androgen Independent，AI)前列腺癌细胞的生长过程中发挥着重要的作用。在不同来源的前列腺癌细胞中，前列腺癌细胞中的USP33表达量明显高于正常前列腺细胞，其中又以雄激素非依赖细胞中更明显。在临床收集的前列腺标本中，我们也发现前列腺癌组织中的USP33表达量明显高于前列腺增生组织。在不同前列腺癌细胞系中，通过干扰及过表达等实验方法，发现USP33能够促进前列腺癌细胞包括雄激素非依赖前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。PC3细胞是用于研究雄激素非依赖前列腺癌的经典细胞系，因此在之后的实验中成为本课题主要研究的细胞系。PC3细胞的主要特点是不表达雄激素受体AR(Androgen Receptor)。在PC3细胞中干扰或过表达USP33之后，结果显示USP33可以抑制PC3细胞的凋亡。利用Western blotting技术，发现干扰了USP33能够增加PC3细胞中磷酸化JNK和P38的水平。利用免疫共沉淀及质谱分析技术，我们发现USP33可以和DUSP1(Dua1 specificity protein phosphatase1)相互结合，并且能够通过逆转DUSP1的K48多聚泛素化修饰而抑制它的降解从而增加DUSP1的表达量。在临床标本中，我们发现USP33高表达的前列腺癌组织中也伴随着DUSP1的高表达。因为DUSP1在以往的报道中能够通过抑制JNK1/2和P38的活化而抑制不同细胞包括肿瘤细胞的凋亡，因此我们也检测了USP33对AI细胞PC3凋亡的影响。我们发现，干扰了USP33能够明显促进PC3细胞的凋亡，但当体系中加入DUSP1过表达质粒或JNK1/2和P38的抑制剂后，这种效应就得到了逆转。通过荷瘤小鼠干扰RNA治疗模型，我们发现瘤内注射USP33的小干扰RNA能明显减缓PC3细胞荷瘤组织的生长。
　　结论:在前列腺癌细胞尤其是雄激素非依赖的前列腺癌细胞中，USP33能够通过去除DUSP1的K48多聚泛素化修饰，从而抑制其通过泛素蛋白酶体途径的降解过程，提高其在前列腺癌细胞中的表达，进一步通过DUSP1的磷酸酶活性抑制JNK1/2和P38信号通路的活化从而抑制JNK1/2、P38依赖的细胞凋亡并影响细胞的生长。该研究创新性的发现了USP33在前列腺癌细胞中的新功能，同时发现了它新的作用底物DUSP1以及对DUSP1的调控方式，也为雄激素非依赖前列腺癌的治疗提供了潜在的治疗靶点，为雄激素非依赖前列腺癌的研究提供了新的参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分：前列腺癌组织及细胞系中USP33表达及功能分析

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

第二部分：USP33调节前列腺癌生长的机制探讨及体内实验治疗模型

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

全文小结

参考文献

文献综述 去泛素化酶在肿瘤中的研究进展及潜在治疗价值

在读期间论文发表和科研工作情况说明

致谢