miR-146a在白念珠菌引发的固有免疫应答中的调节作用

摘要

白念珠菌是一种寄生于人体粘膜和皮肤表面的条件致病菌。正常情况下，其并不引起感染性疾病，但当机体免疫力下降或受到抑制时，白念珠菌趁虚而入，轻则引起各种癣病，重则引起系统性的念珠菌感染。系统性念珠菌感染病情凶险，治疗十分棘手，患者往往预后较差。
　　白念珠菌穿过人体的皮肤和粘膜屏障后，首先被免疫系统的抗原递呈细胞(APC)所感知。常见的APC包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等，其表面表达高水平的模式识别受体(PRR)，负责在第一时间感知入侵机体的白念珠菌。PRR感知白念珠菌的分子基础是识别器表面的病原体相关分子模式(PAMP)。根据分子结构和功能，PRR分为很多种，包括Toll样受体(TLR)、维甲酸诱导基因样受体(RLRs)和NOD样受体(NLR)。由于白念珠菌的体积较大，PAMP的种类较多，因此参与其免疫识别的PRR也较多。以前的研究表明TLR家族的TLR2、TLR4和TLR6均参与了念珠菌的免疫识别。此外，NLR家族的Dectin-1、Dectin-2等也参与了白念珠菌的免疫识别。
　　当白念珠菌与APC表面的PRR结合后，胞内多条信号通路被迅速活化，最终导致APC在感染部位迅速释放各种炎症因子，比如白细胞介素1(IL-1)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和Ⅰ型干扰素等，在第一时间促进白念珠菌的免疫清除。另一方面，APC将白念珠菌吞噬，对其抗原进行消化处理，并将抗原片段递交给T细胞，同时分泌各种细胞因子，如IL-12，转化生长因子β(TGF-β)等，在局部形成特定的细胞因子格局，指导后续的获得性免疫应答过程。
　　针对白念珠菌的免疫应答必须处在精细的调控之中。一方面，炎症反应过度会导致机体的免疫病理损伤。另一方面，如果炎症反应强度不足或持续时间过短，则无法清除入侵机体的病原菌，最终导致病原菌扩散。
　　microRNA是一类长度在18-25个碱基的短链非编码RNA。以往的研究表明其广泛地参与了免疫细胞的分化发育以及免疫应答的调控过程。多个研究表明miR-146a是一个免疫调节功能十分活跃的分子，广泛参与了TLR信号通路、RIG-Ⅰ信号通路的负向调节过程。在前期研究中，我们采用microRNA芯片分析了热灭活白念珠菌刺激人单核源性树突状细胞(Mo-DCs)的microRNA表达谱，发现miR-146a表达上调，但该结果尚未得到PCR的证实，且miR-146a表达增高的生物学意义仍不明确。在本研究中，我们对miR-146a在白念珠菌引发的固有免疫应答中的作用进行了探讨。
　　第一部分 热灭活白念珠菌通过NF-κB依赖性的方式上调细胞内miR-146a的表达
　　我们首先以热灭活白念珠菌刺激THP-1细胞、RAW264.3，单核源性树突状细胞和PMA诱导的巨噬细胞，然后采用RT-PCR检测miR-146a的表达变化情况，发现白念珠菌刺激可以上调细胞内miR-146a的表达。我们采用NF-κB的抑制剂PDTC预处理细胞，然后再以白念珠菌进行刺激，观察NF-κB被抑制后，miR-146a的表达变化情况，结果发现PDTC可以部分下调miR-146a的表达，说明白念珠菌上调miR-146a的表达在一定程度上依赖于NF-κB。此外，由于此前的研究表明Dectin-1是参与白念珠菌免疫识别的PRR之一，因此我们采用昆布多糖封闭Dectin-1，再用白念珠菌进行刺激，观察miR-146a的表达变化情况。结果发现昆布多糖对miR-146a的表达无影响。我们还采用Dectin-1激动剂Curdlan活化THP-1细胞，也发现细胞内miR-146a的表达丰度不受影响。这些结果说明，白念珠菌可以通过NF-κB上调细胞内miR-146a的表达，但这种上调miR-146a表达的功能与Dectin-1无关。
　　第二部分 miR-146a负向调节热灭活白念珠菌诱导THP-1细胞释放干扰素β的能力
　　之后，我们进一步分析了白念珠菌上调miR-146a表达的生物意义。我们用热灭活白念珠菌刺激THP-1细胞，采用ELISA法检测培养基内干扰素β(IFN-β)的表达水平，用RT-PCR法检测IFN-β、干扰素刺激基因(ISG)基因2-5-寡腺苷酸合成酶(OAS-1)和抗粘病毒蛋白1(MX1)的表达。结果发现热灭活白念珠菌可以促进THP-1细胞释放IFN-β，上调OAS-1和MX1的表达。我们将miR-146amimic和inhibitor转染入THP-1细胞，再用热灭活白念珠菌进行刺激，并用ELISA计策培养基内的IFN-β水平，以RT-PCR法检测OAS-1和MX1 mRNA的表达。发现miR-146amimic可以抑制白念珠菌诱导THP-1细胞释放IFN-β的能力，而miR-146ainhibitor则可以增强白念珠菌诱导THP-1细胞释放IFN-β的能力，说明miR-146a是IFN-β的负向调节因子。此外，我们还发现，miR-146amimic可以抑制白念珠菌上调OAS-1和MX1的能力，而miR-146ainhibitor则发挥了相反的作用。这些结果表明，在热灭活白念珠菌刺激的THP-1细胞中，miR-146a表达上调的生物学意义可能在于负向调节IFN-β的释放，并由此负向调控了ISG的表达。
　　第三部分 miR-146a作用靶点分析
　　由于此前有研究表明白念珠菌刺激单核源性树突状细胞表达IFN-β与干扰素调节因子5(IRF5)有关，而生物信息学预测又发现IRF5是miR-146a的作用靶点。因此我们拟进一步分析IRF5是否是miR-146a的作用靶点。我们采用热灭活白念珠菌刺激THP-1细胞后，发现IRF5在mRNA和蛋白水平的表达并没有明显的变化。将miR-146amimic或inhibitor转染入THP-1细胞后，然后用热灭活白念珠菌进行刺激，IRF5的表达也没有受到影响。因此我们确定IRF5并非miR-146a的作用靶点。接下来，我们用生物信息学软件预测到一个名为IFIT3的ISG是miR-146a的作用靶点。用热灭活白念珠菌刺激THP-1细胞后，我们发现IFIT3的mRNA和蛋白均呈现出先增高，后降低的趋势，提示miR-146a可以调节IFIT3的表达。我们将miR-146amimic或inhibitor转染入THP-1细胞，并以外源性的IFN-β进行刺激，发现miR-146a的确可以下调IFIT3的表达。我们进一步采用报告基因技术验证miR-146a与IFIT3 mRNA的3'UTR是否有相互作用，却发现二者之间无相互作用。因此，miR-146a调节可能是通过间接作用调节IFIT3的表达。综上，我们认为在白念珠菌刺激的THP-1细胞中，miR-146a并不是通过IRF5调节IFN-β的表达，其虽然可以调节IFIT3的表达，但是并不是直接的相互作用，而是通过间接作用调节其表达。
　　第四部分 mi-146a通过IFIT3调节THP-1细胞的凋亡
　　考虑到miR-146a可以调节IFIT3的表达，而以往的研究表明IFIT3与细胞凋亡有关。因此，我们接下来研究了miR-146a是否调节了THP-1细胞的凋亡，同时也分析了miR-146a调节THP-1细胞的凋亡是否与IFIT3有关。我们首先将miR-146ainhibitor或mimic转染入THP-1细胞，然后用白念珠菌对其进行刺激，采用AnnexinⅤ-PI法检测细胞的凋亡状况。结果我们发现:miR-146amimic可以促进细胞的凋亡，而miR-146ainhibitor对细胞凋亡影响不显著。这些结果表明miR-146a是促进细胞凋亡的因素。随后，我们采用siRNA技术抑制IFIT3的表达，然后再用热灭活白念珠菌对THP-1细胞进行刺激。结果发现IFIT3表达下调后，细胞的凋亡增加。这说明IFIT3具有抗凋亡作用。综上，这部分结果说明了miR-146a具有促凋亡作用，其促凋亡的作用可能是通过下调IFIT3的表达来实现的。
　　结论:
　　综上，本研究的主要发现是:白念珠菌可以通过活化NF-κB的方式上调THP-1细胞内miR-146a的表达，这种上调作用与参与白念珠菌识别的模式识别受体Dectin-1无关。MiR-146表达上调具有两个生物学意义:第一，负向调节IFN-β的产生，并由此调节了多个ISG的表达，且我们的研究证实miR-146a的这种生物学功能与其理论靶点IRF5无关;第二，miR-146a通过IFN-β→IFIT3轴调节细胞的凋亡。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 热灭活白念珠菌可以通过NF-κB上调细胞内miR-146α的表达

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第二部分 miR-146α负向调节热灭活白念珠菌诱导THP-1细胞释放干扰素β的能力

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

第三部分 miR-146α作用靶点分析

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第四部分 miR-146α以及IFIT3调节THP-1细胞的凋亡

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

总结

参考文献

文献综述

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