TLR4通过p38/Il-1β信号通路参与SMIR诱导持续性术后疼痛的机制研究

摘要

目的:
　　持续性术后疼痛严重影响患者术后的生活质量，目前已经成为一个重要的临床问题。然而，持续性术后疼痛的机制仍不明了。本研究的目的是阐明背根神经节（dorsal root ganglia,DRG）中Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR4)及其与p38和IL-1β信号通路的相互作用对持续性术后疼痛的影响。
　　方法:
　　1.检测SMIR术后大鼠机械撤足阈值(paw withdrawal threshold，PWT)的变化，及大鼠DRG中TLR4表达情况。
　　1.1 用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠行皮肤肌肉切口牵开术(skin and muscleincision and retraction，SMIR)。SMIR术前1天及术后第1、5、10、20天检测大鼠手术侧和手术对侧后足的PWT。
　　1.2 SMIR术前1天及术后1、5、10、20天取大鼠术侧L3、L4 DRG，检测TLR4蛋白水平。
　　1.3 SMIR术后第10天取术侧L3、L4 DRG，免疫荧光检测TLR4所表达细胞类型。
　　2.观察SMIR术后大鼠DRG中MAPKs家族成员变化情况。
　　2.1 分别于SMIR术前1天及术后第1、5、10、20天取大鼠术侧L3、L4 DRG，检测MAPKs家族成员磷酸化水平。
　　2.2 SMIR术前30min至术后第10天每天鞘内分别注射不同剂量p38 MAP激酶抑制剂SB203580（1μg、10μg、50μg）及相同体积的溶剂，观察大鼠PWT变化。在未手术组(Naive)鞘内连续注射SB20358010μg作为对照，观察其PWT变化。
　　3.观察SMIR术后DRG中TLR4对PWT影响极其与p-p38之间关系
　　3.1 从SMIR术前30min至术后第10天每天鞘内分别注射不同剂量TLR4拮抗剂LPS-RS（5μg、25μg、50μg）及相同体积的溶剂，观察大鼠PWT变化。在未手术组(Naive)鞘内连续注射LPS-RS25μg作为对照，观察其PWT变化。
　　3.2 SMIR术后第10天取术侧DRG，免疫荧光检测TLR4与p-p38的表达位置。
　　3.3 从SMIR术前30min至术后第10天每天鞘内分别注射LPS-RS25μg，于第10天取大鼠DRG，检测p-p38蛋白水平。
　　4.观察SMIR术后DRG中IL-1β蛋白水平，研究TLR4、p-p38对IL-1β影响。
　　4.1 分别于SMIR术前1天及术后第1、5、10、20天取大鼠术侧L3、L4 DRG，检测IL-1β蛋白水平。
　　4.2 从SMIR术前30min至术后第10天每天鞘内分别注射不同剂量IL-1受体拮抗剂IL-1ra（10μg、50μg、100μg）及相同体积的溶剂，观察大鼠PWT变化。在未手术组(Naive)鞘内注射IL-1ra50μg作为对照，观察其PWT变化。
　　4.3 从SMIR术前30min至术后第10天每天鞘内分别注射LPS-RS25μg、SB20358010μg，于第10天取大鼠DRG，检测IL-1β水平。
　　结果:
　　1.SMIR术后大鼠术侧PWT降低，DRG中TLR4表达升高。
　　1.1 SMIR术后第5、10、20天，大鼠术侧PWT与术前相比显著下降(n=12，P＜0.05)。
　　1.2 SMIR术后第5、10、20天，术侧L3、L4 DRG中TLR4表达水平与术前相比显著升高（n=6，P＜0.05）。但是在SMIR术后第1天，TLR4水平与术前相比无显著改变。
　　1.3 免疫荧光染色显示，TLR4与IB-4、NF-200（神经元标记物）存在共染，但与GFAP（胶质细胞标记物）无共染。
　　2.MAPKs家族成员中的p-p38在SMIR术后表达显著升高，且影响大鼠PWT。
　　2.1 与术前相比，SMIR术后第5、10、20天，大鼠DRG中p-p38水平显著升高(n=6，P＜0.05)。p-ERK及p-JNK水平却无显著改变。
　　2.2 SMIR术后第5、10、20天，鞘内注射10μg、50μg SB203580组大鼠术侧PWT与溶剂组相比显著升高（n=12，P＜0.05）。1μg组与溶剂组相比，大鼠术后PWT无显著改变。Naive组鞘内注射10μg SB203580，其PWT无显著改变。
　　3.TLR4拮抗剂LPS-RS可使SMIR术后PWT升高、p-p38下降。
　　3.1 SMIR术后第5、10、20天，应用25μg、50μg LPS-RS组大鼠PWT与溶剂相比显著升高(n=12，P＜0.05)。5μg组与溶剂相比，大鼠PWT无显著改变。Naive组鞘内注射25μg LPS-RS，大鼠PWT无显著改变。
　　3.2 免疫荧光染色显示TLR4与p-p38共染。
　　3.3 在SMIR术后第10天，25μg LPS-RS组大鼠DRG中p-p38水平较SMIR组显著降低(n=6，P＜0.05)。
　　4.SMIR术后TLR4和p38通路通过上调IL-1β表达，参与了SMIR诱导的痛觉过敏。
　　4.1 SMIR术后第5、10、20天，大鼠术侧L3、L4 DRG中IL-1β比术前显著升高(n=6，P＜0.05)
　　4.2 SMIR术后第5、10、20天，50μg、100μg IL-1ra组大鼠术侧PWT与溶剂组相比，显著升高（n=12，P＜0.05）。10μg组与溶剂相比，大鼠术侧PWT无显著改变。Naive组鞘内注射50μg IL-1ra，大鼠PWT无显著改变。
　　4.3 在SMIR术后第10天，25μg LPS-RS、10μg SB203580组大鼠DRG中IL-1β水平较SMIR组显著降低（n=6，P＜0.05）。
　　结论:
　　本实验结果表明在SMIR术后p38及IL-1β信号通路是由TLR4所介导激活，参与调节持续性术后疼痛。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、材料

(一)实验动物

(二)主要抗体和试剂

(三)主要试剂的配制

(四)主要仪器

二、方法

(一)实验模型

(二)50％PWT值的检测

(三)用于Western Blotting的DRG取材

(四)用于免疫荧光的DRG取材

(五)大鼠鞘内给药

(六)蛋白印记Western Blotting

(七)免疫荧光

(八)统计分析

三、实验结果

(一)SMIR诱导产生机械痛觉过敏，DRG中TLR4表达上调

(二)MAPKs家族成员激活参与了SMIR诱导产生的机械痛觉过敏

(三)SMIR术后大鼠DRG中TLR4参与了p38的活化，进而影响SMIR大鼠术后机械痛觉敏

(四)TLR4和p38通路通过上调IL-1β表达，参与SMIR诱导产生的机械痛敏

四、讨论

五、小结

参考文献

综述

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢