二甲双胍对甲状腺功能减退大鼠的甲状腺激素的作用及机制探讨

摘要

本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 目的： 2型糖尿病和甲状腺疾病是最为常见的两种内分泌疾病。胰岛素抵抗（IR）和高胰岛素血症是2型糖尿病发病的关键因素。目前，关于甲状腺功能异常和糖尿病的相关性已有较多研究，对于1型糖尿病患者与甲状腺结节发生的关系也有不少临床资料的报道，但2型糖尿病的报道相对稀缺。本实验主要探讨2型糖尿病与甲状腺功能异常和甲状腺结节发生率的关系。 方法： 研究人群来源于2015年3月至2016年9月期间上海长征医院内分泌科和体检中心。收集人群分为2型糖尿病（DM）组和非糖尿病对照（C）组。采集相关资料项目包括年龄、性别、身高、体重和病程病史情况。收集检测指标包括血清三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、促甲状腺激素受体抗体（TSHR-Ab)、空腹血糖（FBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）。通过统计学方法分析糖尿病组与非糖尿病组之间甲状腺功能的差异以及甲状腺结节发生率与糖尿病的相关性。 结果： 1、本研究纳入被研究者共320例，其中糖尿病（DM）组180例（男性123例，女性57例），非糖尿病对照（C）组140例（男性91例，女性49例）。其中糖尿病组平均病程为12.4±8.0年（男性11.3±7.1年，女性15±9.62年）。糖尿病组与对照组相比，HbA1c和FBG明显高于对照组（P＜0.01），而男女比例、年龄、BMI均无统计学差异。另外糖尿病组和对照组人群中女性年龄均高于男性（P＜0.05），对照组中男性BMI高于女性（P＜0.05）。 2、通过ANOVA方法比较糖尿病组和对照组的甲状腺功能，如表2和图1结果显示：糖尿病组T3、FT3水平低于对照组（P＜0.01），TSH高于对照组（P＜0.05）。而糖尿病组和对照组女性FT3水平均低于男性（P＜0.01），对照组中女性T3水平低于男性（P＜0.01）。分别以T3、T4、FT3、FT4、TSH为应变量，年龄和BMI为协变量，通过协方差分析方法比较糖尿病组与非糖尿病组甲功的差异。 结果显示，T3和FT3糖尿病组均低于正常组，而TSH高于正常组，差异有统计学意义，P值均＜0.05。其他指标无统计学差异。 3、Spearman非参数相关性分析糖尿病人群中影响甲状腺激素因素。 结果显示不论男女，糖尿病患者甲功尤其是FT3与年龄和糖化血红蛋白成负相关，其中男性P＜0.01，而女性P＜0.05。另外男性和女性FT3与年龄成明显负相关，P＜0.01。其中男性糖尿病患者T3、FT3与糖化血红蛋白成负相关系数分别为：r=-0.323，-0.482，P＜0.01。女性糖尿病患者FT3与糖化血红蛋白成负相关系数为：r=-0.390，P＜0.05。对不同性别分别对FT3进行多元线性逐步回归分析：结果显示，对于男性和女性，糖化血红蛋白HbA1c均与FT3水平呈正相关(β=0.366、0.315，P值均＜0.01)。 4、通过卡方检验，糖尿病组与对照组的结节患病率有统计学差异，P＜0.05。通过logistics回归分析，排除BMI和年龄的影响，糖尿病组与对照组相比发现甲状腺结节的相关系数β=0.693，OR=2.00，P＜0.05。 结论：甲状腺结节患病率随着HbA1c的增加而明显升高。这可能与胰岛素信号通路相互作用有关。从初次诊断的糖尿病患者中进行甲状腺超声和甲状腺功能筛选，有助于糖尿病患者早期诊断、预防和治疗甲状腺功能异常和甲状腺结节等疾病。 第二部分 目的：近年来研究表明，二甲双胍能降低糖尿病合并甲状腺功能减退（简称甲减）或者亚临床甲状腺功能减退患者的TSH水平，其机制尚不明确。但目前为止，关于二甲双胍对甲状腺功能减退动物模型的作用尚无报道。二甲双胍对甲状腺功能的研究仅限于有限的临床资料研究，而对于二甲双胍对甲状腺激素改变及其机制尚缺乏动物实验研究。本实验采用氨基三唑（AMT）构建甲状腺功能减退的动物模型，再通过二甲双胍灌胃8、12周，检测甲状腺激素的水平，研究二甲双胍对甲状腺功能减退模型大鼠甲状腺激素轴的影响，并通过检测甲状腺钠碘同向转运体（NIS）、甲状腺HE染色等指标对其机制进行初步探讨。 方法：取3月龄雄性SD大鼠36只，随机分为正常对照（NC）组、甲状腺功能减退大鼠模型（HT）组、二甲双胍（Met）组，每组12只。HT组和Met组以含0.01%氨基三唑的饮用水喂养大鼠4周制备甲状腺功能减退大鼠模型，NC组大鼠喂养普通饮用水。造模成功后，Met组用200mg/kg二甲双胍灌胃，HT组和NC组用等体积5%羟甲基纤维素钠(Na-CMC)灌胃，于灌胃第8周时对3组大鼠甲状腺组织行HE染色，采用qPCR检测下丘脑促甲状腺激素释放激素前体（pro TRH）mRNA的表达；于灌胃第8、第12周时采用电化学发光法检测3组大鼠血清T3、T4，采用qPCR和蛋白质印迹法检测甲状腺组织钠碘同向转运体(NIS)，下丘脑AMPK mRNA和蛋白表达。 结果： 1、NC组大鼠毛发整齐，有光泽，随时间增加而体重增长。而饮用0.01%AMT水4周的HT组和Met组大鼠体重几乎没有增加或者增长缓慢，毛发较杂乱，色泽轻微晦暗，精神较差，摄食饮水均明显少于NC组。称量体重显示：造模后HT组、Met组大鼠体重均低于NC组大鼠，有统计学差异（P＜0.05），而HT组与Met组无统计学差异。灌胃8周和12周后，称量体重显示：HT组、Met组大鼠体重均低于NC组大鼠，有统计学差异（P＜0.05）,而HT组与Met组无统计学差异。 2、对灌胃12周后的各组大鼠甲状腺组织连同气管切除并拍照，甲状腺外观图片显示：NC组大鼠甲状腺颜色淡红，峡部菲薄，两侧甲状腺对称而体积正常。而HT组甲状腺颜色暗红，血流丰富，峡部明显增厚，两侧甲状腺不规则肿大。Met组甲状腺较HT组颜色淡，相对HT组峡部较薄，甲状腺肿大较HT组改善。 3、HE染色结果显示正常组滤泡大小不等，内见大量内胶质及吸收空泡；而HT组大鼠甲状腺滤泡缩小，滤泡上皮增生成柱状，滤泡周围吸收空泡减少，部分滤泡间纤维组织增生；Met组甲状腺滤泡大小不等，滤泡上皮细胞增生较HT组稍改善。 4、成模后用毛细管取各组大鼠眼眶血1ml左右，用于检测甲状腺功能，结果显示：饮用0.01%AMT水4周后检测各组眼眶血血清中T3、T4水平：HT组、Met组大鼠T3、T4水平均明显低于NC组，有统计学差异（P＜0.05）。灌胃8周、12周后检测各组动脉血血清：HT组大鼠T3、T4水平均明显低于NC组，有统计学差异（P＜0.05）；而Met组T3、T4均明显高于HT组，有统计学差异（P＜0.05）。灌胃8周后，HT组大鼠下丘脑ProTRH mRNA水平高于NC组，有统计学差异（P＜0.05）；而Met组低于HT组，有统计学差异（P＜0.05）。 5、对灌胃8周后的各组大鼠下丘脑组织行Western Blot检测AMPKα、p-AMPKα蛋白。 结果显示：HT、Met组AMPKα条带无明显改变，HT组而p-AMPKα/AMPKα灰度值比低于NC组，有统计学差异（P＜0.05），而Met组与HT组，p-AMPKα/AMPKα灰度值比无明显改变。 6、检测大鼠甲状腺组织中NIS mRNA和蛋白表达水平，结果显示灌胃8周后，HT组NIS mRNA水平高于NC组（P＜0.05），NIS蛋白差异无统计学意义，而Met组大鼠甲状腺组织中NIS mRNA和蛋白表达均低于HT组（P＜0.05）；灌胃12周时，HT组大鼠甲状腺组织中NIS mRNA表达与Met组差异无统计学意义，但Met组NIS蛋白表达高于HT组（P＜0.05）。 结论：二甲双胍可改善甲状腺功能减退模型大鼠甲状腺激素水平，但短期甲状腺功能改善并不是由甲状腺NIS表达升高所致，其机制仍需要进一步研究。二甲双胍可能为糖尿病以及甲状腺功能减退的综合治疗，或者甲状腺肿瘤术后的TSH抑制治疗提供新的思路和方法。

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