髓核细胞中p38亚型的差异性表达及其对椎间盘退变中巨噬细胞的极化作用研究

摘要

第一部分:髓核细胞中p38亚型的差异性表达及其在椎间盘退变中的作用及机制研究
　　研究背景:椎间盘(Intervertebral disc，IVD)位于椎体之间，主要由髓核(Nucleuspulposus，NP)和纤维环(Annulus fibrosus，AF)构成，是人体脊柱结构的重要组成部分。其生理功能主要包括参与脊柱屈、伸、旋转等运动功能，维持椎间隙高度，以及承载负荷和分散应力等。目前已经证实，椎间盘退行性病变(Intervertebral discdegeneration，IDD)是引起下腰痛(Low back pain，LBP)及成人腰椎间盘突出症的主要原因之一。近年来，随着椎间盘内炎性介质对椎间盘影响的研究快速发展，炎性反应(Inflammation)成为了椎间盘退变的重要研究方向。促炎因子(Pro-inflammatorycytokines)如TNF-α、IL-1、COX-2、IL-6、IL-8，IL-10以及基质金属蛋白酶类(Matrixmetalloproteinases，MMPs)等均和腰椎间盘退变有关。而上述相关产物的基因表达都与丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)息息相关。
　　丝裂原活化蛋白激酶是一种细胞外刺激经过一系列转导引起细胞核反应的重要信号通路。P38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要成员，在细胞内担负着将细胞外各种有丝分裂和应急信号传递至细胞核以及调节相关基因表达从而介导细胞产生一系列反应的重要使命，是细胞内主要的信号转导系统。在椎间盘退变过程中，髓核细胞中p38 MAPK发挥了重要作用。椎间盘退变时，促炎因子(Pro-inflammatory cytokines)大量分泌聚集，此时，p38 MAPK介导髓核细胞多种分解代谢酶如ADAMTS-4、ADAMTS-5以及MMPs等表达增高。这些分解代谢酶类表达增强导致collagen-Ⅱ(Col-Ⅱ)、aggrecan等椎间盘细胞外基质成分大量降解。此外，p38 MAPK信号通路还参与一系列椎间盘退变的细胞生理病理过程如凋亡、自噬、缺氧、血管翳生成等密切相关。P38 MAPK家族有四个成员:p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK12/ERK-6)以及p38δ(MAPK13/SAPK4)。这四种亚型的同源性达60％，但却由不同的上游激酶—丝裂原活化蛋白激酶激酶-3、-4、-6(MKK-3、MKK-4、MKK-6)—选择性磷酸化。值得注意的是，尽管p38 MAPK在椎间盘退变过程中发挥了重要作用，然而有关p38 MAPK各亚型在参与椎间盘退变中的具体作用机制尚不清楚。本实验研究首次证实了p38α、p38β、p38δ三种亚型在上游激酶MKK-3的的作用下激活进而在椎间盘退变中发挥重要作用，其中，p38α、p38β可以增强ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等细胞外基质降解酶类的表达，降低Ⅱ型胶原(Collagen-Ⅱ)、聚蛋白聚糖(Aggrecan)等基质大分子从而加剧退变，而p38δ则相反，其抑制ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等表达同时增强基质成分aggrecan的表达而对椎间盘起保护作用。
　　目的:探讨p38 MAPK四种亚型各自在退变椎间盘髓核细胞中的表达情况，研究其上游激酶的活化情况，系统探讨在椎间盘退变中p38 MAPK各亚型对相关分解代谢酶类及促炎因子的调节作用及机制。
　　方法:采用免疫印迹分析(Western blot analysis)方法分别检测p38 MAPK四种亚型在退变的椎间盘髓核及纤维环组织中的表达水平;采用免疫印迹(Westernblot)方法分别检测退变髓核组织中p38α、p38β、p38γ以及p38δ亚型的表达水平;采用免疫印迹分析方法对分级后的退变椎间盘髓核组织中p38 MAPK各亚型及磷酸化p38 MAPK进行检测以研究各亚型表达水平与椎间盘退变程度的关系;利用免疫双荧光标记法(Double-labeling immunofluorescence stain)同时标记CD24及p38MAPK各亚型，研究各亚型的表达情况;利用免疫双荧光标记法研究p38 MAPK各亚型在退变髓核细胞中的激活情况，利用拉下实验(Pull-down)进一步确认p38MAPK各亚型在退变椎间盘髓核细胞中的激活情况;利用免疫印迹方法进一步分别检测正常及不同退变程度椎间盘组织中p38 MAPK上游激酶MKK-3、MKK-4、MKK-6活化情况;为检测p38 MAPK各亚型在椎间盘退变炎症反应中的作用，利用慢病毒转染技术分别沉默p38α、p38β、p38γ以及p38δ的表达，利用定量核酸扩增检测系统(Real-time quantitative PCR，q-PCR)和WB法证实沉默效果，随后利用q-PCR法检测IL-1β干预髓核细胞后，p38 MAPK各亚型对椎间盘退变相关指标ADAMTS-4、ADAMTS-5,MMPs-13,CCL-3,collagen-Ⅱ、aggrecan等mRNA的表达水平的影响。
　　结果:Western blot analysis显示，与纤维环组织相比，p38 MAPK在退变的髓核组织中表达上调;利用Western blot方法可以检测出退变髓核组织中p38α、p38β、p38δ表达，而p38γ并不表达;不同退变程度的椎间盘髓核组织中p38各亚型及磷酸化p38(p-p38)表达情况检测结果显示，p38α、p38β及p-p38表达同退变严重程度呈正相关;利用免疫双荧光标记检测发现高达83％的细胞显示CD24和p38α双阳性，78％的阳性细胞CD24和p38β双阳性，p38δ和CD24双阳性的细胞表达率为56％，而p38γ和CD24双阳性的细胞仅为9％左右;分别对p38各亚型及磷酸化p38进行免疫双荧光标记，发现约38％的细胞p38α和磷酸化表现同时阳性，33％的细胞p38β和磷酸化表现同时阳性，而p38δ及p38γ阳性同时磷酸化的细胞仅分别为24％和5％;进一步检测p38上游激酶活化，发现仅有MKK-3表达上调，MKK-4，MKK-6未有明显变化，MKK-3恰是激活p38α、p38β、p38δ的上游激酶;利用IL-1β干预人椎间盘细胞24小时后，利用q-PCR法检测发现ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3等的mRNA表达上调，而collagen-Ⅱ及aggrecan的表达降低，利用慢病毒转染技术分别抑制p38α、p38β可显著降低ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3的表达，但是抑制p38δ却发现ADAMTS-4、ADAMTS-5表达明显增强，此外，q-PCR检测发现，抑制p38α、p38β可以恢复collagen-Ⅱ、aggrecan的mRNA表达，抑制p38δ却对aggrecan表达起抑制作用。
　　结论:1.退变的椎间盘髓核组织p38 MAPK表达上调，其四种亚型中，p38α、p38β、p38δ被激活并起到主导作用，而p38γ表达较弱或不表达;p38α、p38β随着椎间盘退变程度加重表达增加。2.椎间盘退变时，MKK3是激活p38的上游激酶，其激活的亚型恰为p38α、p38β、p38δ。3.抑制p38α、p38β的表达可降低IL-1β诱导的退变相关产物如ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13、CCL-3等的表达，同时增强collagen-Ⅱ、aggrecan等细胞外基质的表达水平，说明p38α、p38β促进退变发生;而p38δ则相反，抑制p38δ表达后，IL-1β诱导的促进退变相关因素如ADAMTS-4、ADAMTS-5，MMPs-13等的表达增强，而细胞外基质成分aggrecan的表达被明显抑制，说明椎间盘退变过程中p38δ可能在一定程度上对椎间盘起保护作用。
　　第二部分:椎间盘退变中髓核细胞p38亚型的差异性表达对巨噬细极化用研究
　　研究背景:下腰痛(Low back pain，LBP)是一类最常见的临床病症。据不完全统计，在美国约有80％的成年人曾有过下腰痛的经历，而目前每年仅用于其治疗和康复的费用达数百亿美元之多。我国的下腰痛发病率与美国无明显差异，而患者数量估计为美国的4-5倍。目前已经证实，椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因之一。尽管目前关于椎间盘退变的确切发病机制尚未完全清楚，但普遍观点认为以年龄、机械应力、炎性反应、创伤、内分泌以及营养状态为主的多重因素在其发生发展中发挥了重要的作用。目前公认在椎间盘退变过程中，p38 MAPK发挥了重要作用。椎间盘退变时，促炎因子(Pro-inflammatorycytokines)大量分泌聚集激活髓核细胞中的p38 MAPK，介导分泌更多促炎因子，从而加剧椎间盘的炎性反应，同时，p38 MAPK介导髓核(Nucleus pulposus，NP)细胞产生多种分解代谢酶如ADAMTS-4、ADAMTS-5以及MMPs等大量降解细胞外基质，同时p38 MAPK的激活还抑制了基质主要成分如collagenⅡ、aggrecan等的表达进一步加重退变。此外，p38 MAPK信号通路还参与一系列椎间盘退变的细胞生理病理过程如凋亡、自噬等。
　　研究表明，巨噬细胞在如骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)、类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）等多种炎性疾病中发挥了重要作用，我们的前期工作表明，退变的椎间盘髓核组织中，巨噬细胞可能是唯一浸润的炎症细胞，但其在椎间盘退行性病变中的作用及机制尚不清楚。值得注意的是，有研究表明，在促炎因子刺激下，髓核细胞可以通过p38 MAPK介导趋化因子配体3(CCL3)诱导巨噬细胞的迁移。当巨噬细胞迁移至受伤组织后，会由于微环境的影响，巨噬细胞可被诱导极化分为两型:M1型及M2型，M1型巨噬细胞起清除外源物及受损细胞的作用，M2型则促增殖起修复作用。M1型巨噬细胞特异性表达一氧化氮合酶(iNOS)和CD86，产生大量炎性因子如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-12(IL-12); Arginase-1与CD206为M2型巨噬细胞表面标志物，M2型巨噬细胞主要分泌IL-10及CCL18等免疫调节因子。目前，椎间盘退变中巨噬细胞极化情况尚未有报道。值得一提的是，一系列由p38 MAPK介导椎间盘髓核细胞表达的细胞因子如干扰素γ(IFNγ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)都可以诱使巨噬细胞极化。因而，进一步深入探讨p38 MAPK与巨噬细胞在椎间盘退变中的具体作用机理并阐明巨噬细胞在椎间盘退变中的作用，可以为下一步制定能延缓乃至阻止椎间盘退变的分子生物学治疗方案提供理论依据。
　　目的:研究炎症细胞在退变的椎间盘髓核组织中的浸润情况，探讨巨噬细胞与椎间盘退变的关系及作用机理，明确p38 MAPK与巨噬细胞在椎间盘退变中的具体作用机制，进而为针对椎间盘退变的分子生物学治疗提供一定的理论支撑。
　　方法:利用免疫双荧光标记检测法(Double-labeling immunofluorescence stain)检测退变髓核组织中炎症细胞浸润情况，利用CD20、CD45RO、CD4、CD8等特异性标志物检测淋巴细胞表达情况;利用CD1a、S100检测树突状细胞浸润情况;为进一步明确炎症细胞类型，利用CD45、CD68及CD11b等巨噬细胞表面标记物和CD24(髓核细胞表面标志物)再次进行免疫双荧光检测，因结果提示在髓核组织样本中，仅有CD11b可作巨噬细胞特异性标志物，再次利用CD24和CD11b进行标记证实巨噬细胞是唯一浸润退变椎间盘髓核组织中的炎症细胞。利用免疫双荧光标记法对CD11b阳性的细胞与p38 MAPK各亚型分别表达情况进行研究;利用免疫双荧光标记法检测CD11b阳性的细胞分别表达M1型巨噬细胞表面标志物iNOS或CD86，M2型巨噬细胞表面标志物Arginase-1及CD206的情况，明确巨噬细胞极化类型;为测定髓核细胞对巨噬细胞极化作用的影响，将RAW264.7巨噬细胞与不同退变程度椎间盘组织中的髓核细胞及正常髓核细胞分别共培养3天，利用WB法分别检测iNOS表达情况;为进一步研究髓核细胞中p38 MAPK各亚型对巨噬细胞极化的作用，利用慢病毒转染技术分别抑制退变髓核细胞中p38α、p38β、p38γ以及p38δ，三天后与巨噬细胞共培养，对比iNOS及Arginase-1的表达情况;为明确髓核细胞中诱导巨噬细胞极化的细胞因子产物，利用微量样本多指标流式蛋白定量(Flow cytometric bead array)技术对共培养液中可能与M1型巨噬细胞极化相关的细胞因子进行检测，发现p38α介导表达的IFNγ，p38α、p38β及p38δ介导表达的GM-CSF可能是退变髓核细胞促进巨噬细胞向M1型极化的关键因素;为进一步证实，将原代髓核细胞培养2天后，分别加入抗IFNγ抗体及抗GM-CSF抗体，24小时后与巨噬细胞共培养，明确其各自对巨噬细胞极化作用的影响。
　　结果:利用免疫荧光标记检测(Double-labeling immunofluorescence stain)法结果显示，在退变的椎间盘髓核组织中未发现有淋巴细胞及树突状细胞的浸润，约70％的样本中可以检测到CD11b阳性细胞的表达，提示为巨噬细胞，而所有的正常髓核组织中CD11b均为阴性结果。利用CD45、CD68及CD11b等巨噬细胞表面标记物和CD24(髓核细胞表面标志物)进行免疫双荧光检测后发现，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级退变样本中表现CD45、CD68双阳性的髓核细胞分别为5％、88％、91％、84％;CD24和CD68双阳性细胞在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级退变样本中的比率分别为80％、86％和91％，提示CD68并非巨噬细胞特异性表面标记物，在髓核细胞中只有CD11b可作为巨噬细胞表面标志物，为更明确区别开髓核细胞与巨噬细胞，利用CD24和CD11b进行标记，无细胞同时表现CD24和CD11b阳性，证实巨噬细胞是退变髓核组织中唯一浸润的炎症细胞。利用免疫双荧光标记法检测退变的髓核组织，83％的细胞同时表达CD24和p38α，78％的细胞同时表达CD24和p38β，而CD24和p38β同时阳性的细胞约56％，p38γ与CD24同时阳性的细胞仅占9％，几乎所有CD11b阳性的细胞（约占细胞总数的20％）均同时显示p38α、p38β、p38δ阳性。利用免疫双荧光标记法发现CD11b阳性的细胞都同时表达M1型巨噬细胞的标记物iNOS或CD86的细胞率分别为84％和80％，而表达M2型的表面标志物Arginase-1及CD206的比率分别为5％和7％，提示椎间盘退变时巨噬细胞向M1型极化;为测定椎间盘细胞与巨噬细胞极化的影响，将RAW264.7巨噬细胞分别与不同程度退变的髓核细胞或正常髓核细胞共培养3天，利用Western blot analysis法测得退变髓核细胞组iNOS表达明显增强;为进一步研究髓核细胞中p38各亚型在巨噬细胞极化中的作用，利用慢病毒转染技术分别抑制退变髓核细胞中p38α、p38β、p38γ以及p38δ，三天后将其培养液与巨噬细胞共培养，与对照组相比，sh-p38α组iNOS表达被完全抑制，sh-p38β、p38δ组被不完全抑制，抑制p38γ的表达对巨噬细胞的极化未见影响，同时未检测到Arginase-1的表达。利用微量样本多指标流式蛋白定量技术对共培养液中可能与M1型极化相关的细胞因子进行检测，结果显示分别抑制p38α、p38β、p38γ以及p38δ对TNF-α、IL-1β及MCP-1表达无明显影响，单独抑制p38α可显著抑制 IFNγ的表达，单独抑制p38α、p38β、p38δ可显著抑制GM-CSF的表达;将原代髓核细胞培养2天后，分别加入抗IFNγ抗体及抗GM-CSF抗体，24小时后与巨噬细胞共培养，发现抑制IFNγ可以部分抑制iNOS的表达，而抑制GM-CSF可完全抑制iNOS的表达。
　　结论:1.巨噬细胞可能是退变的椎间盘髓核组织中唯一存在的炎症细胞，其作用更像是对组织损伤的一般性炎症反应而非以淋巴细胞介导的特异性免疫应答。2.椎间盘退变时p38 MAPK表达阳性的髓核细胞释放GM-CSF和IFNγ从而诱导侵入椎间盘的巨噬细胞向M1型极化，其中p38α可介导GM-CSF和IFNγ的分泌表达，p38β、p38δ可介导GM-CSF的分泌表达从而影响巨噬细胞的极化。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 髓核细胞中p38亚型的差异性表达及其在椎间盘退变中的作用及机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分 髓核细胞中p38对巨噬细胞的极化作用及其在椎间盘退变中的作用及机制研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

全文总结

综述 p38 MAPK及巨噬细胞的极化与椎间盘退变

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致谢