雷公藤红素抑制HSP90影响白血病细胞增殖的分子及结构机制研究

摘要

目的: 白血病是造血系统一种恶性肿瘤，是我国十大高发肿瘤之一，预后较差，且发病率呈逐年递增趋势。随着现代医疗技术的发展，白血病的治疗取得很大进展，但仍存在不足，需要探寻新的治疗策略。 目前，白血病的治疗方法主要分为以下几大类：放疗、化疗、靶向治疗、免疫疗法和造血干细胞移植等。每种方法都存在各自的优缺点。放疗和化疗仅针对特定类型白血病有一定疗效，且在杀死肿瘤细胞的同时影响正常细胞的功能，导致副作用大，病人难以耐受；免疫疗法对病人产生的副作用小，病人依从性好，但因涉及细胞体外处理，治疗环节繁琐且目前质量控制难以把握，存在一定风险；造血干细胞移植是目前认为唯一能治愈白血病的方法，其中，自体移植，不受供体来源限制，并发症少，但移植物中可能残存肿瘤细胞，致使复发率高；异体移植，病人需长期服用免疫抑制药物，可能严重影响生活质量。靶向治疗因其治疗目标明确，副作用相对较少，但肿瘤常为多因素所致，容易因靶点过于单一影响疗效。 综合以上分析，寻找一种（或几种）能参与肿瘤发生多个通路的靶点分子，对白血病进行靶向治疗，是未来白血病治疗策略中的重要发展方向和突破点所在。 热休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）在肿瘤发生发展过程中的作用近年来受到越来越广泛的关注。肿瘤细胞中HSP90含量可以比正常细胞高十倍以上，HSP90使肿瘤细胞能在较恶劣的环境生存。HSP90客户蛋白中的很多分子参与了肿瘤形成和进展不同环节。在各种类型的白血病中，均发现HSP90表达显著增高，且与预后不良有关，将HSP90抑制剂与其他治疗白血病药物联合应用，能提高白血病治疗效果。因此，抑制HSP90可能成为白血病靶向治疗新策略，但目前尚无HSP90抑制剂在临床应用，表明对HSP90新抑制剂的发现和作用机制仍需更深入研究。 雷公藤红素是从中药雷公藤中提取出的一种三萜类小分子化合物，具有多种生物活性。本课题组成员在上世纪九十年代即发现，雷公藤红素能诱导淋巴性白血病细胞发生凋亡，开启了雷公藤红素治疗白血病研究。近年来，有研究者用基因表达特征（Gene expression signature，GES）技术证实，雷公藤红素是一种新的HSP90抑制剂。但雷公藤红素抑制HSP90治疗白血病作用机制尚不清楚。 本课题将从HSP90抑制的分子和结构机制方面，深入探讨雷公藤红素治疗白血病的作用机制。 方法: 本课题系统性观察了雷公藤红素对多种白血病细胞增殖影响，和抑制HSP90的情况；利用生物信息学技术，分析和预测雷公藤红素与HSP90结合情况及可能的关键作用基团；通过运用化学、分子生物学、细胞生物学、生物热力学等多种研究方法和实验技术，探讨雷公藤红素抑制HSP90的分子及结构机制。 研究涉及主要方法如下： （一）细胞培养 白血病细胞株常规培养在含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640完全培养基中，培养条件为37℃和5%CO2，并保持适当湿度。根据细胞生长情况，更换新鲜培养液。处于对数生长期的细胞用于实验。 （二）用CFSE标记细胞微球作为内参的、流式细胞计数技术 该技术是本课题组发明的基于流式细胞术的、用绿色荧光物质CFSE标记细胞微球作为内参的、单平台细胞计数技术。用CFSE标记细胞，制作成带荧光的细胞微球，加入一定量到需进行细胞计数的样本中，同时加入用于标记死细胞、带红色荧光的染料7-AAD，利用流式细胞仪不同荧光检测通道，将样本与细胞微球区分，分别进行计数，通过计算，得到样本中活细胞、死细胞和总细胞数。 （三）免疫印迹技术（Western blot） 经药物处理后细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，取一定量蛋白，进行SDS-PAGE，转膜后，封闭，用含针对目的蛋白的一抗、相应的二抗分别孵育后，ECL显色，用化学发光成像系统采集条带，并对条带灰度值进行分析。 （四）生物信息学分子对接技术 用Schrodinger（薛定谔）软件对雷公藤红素和HSP90进行分析，主要步骤为：配体准备：加氢，去盐，异构体识别；受体准备：加氢，去水，补残基；前二步是使配体和受体处于最优构象；定义格点文件：限制对接的位置；进行GLIDE对接，使配体能够与受体很好的接合；定义受体中能够产生共价作用的位置的格点文件；进行Covalent docking得出结果；对结果进行分析。 用PyMOL软件显示分子三维结构图。 （五）人全长HSP90原核和真核表达载体的构建 以已有的人全长HSP90表达载体为模板，PCR扩增，琼脂糖电泳回收PCR产物，通过两个不同的酶切位点对PCR产物和相应质粒骨架载体进行双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物后，酶连载体及PCR产物，转化酶连产物，涂板，挑单克隆，摇菌，送样测序，挑选测序正确的菌落，接种摇菌，抽提质粒，再次测序验证构建载体序列的正确性。 （六）野生型和突变型HSP90蛋白表达和纯化 以野生型HSP90原核表达载体质粒为模板，利用PCR方法定点突变目标氨基酸位点，得到突变型原核表达载体质粒。将野生型和突变型HSP90原核表达载体质粒转化ArcticExpressTM(DE3)原核宿主菌，使用IPTG诱导细菌表达目的蛋白。通过Ni柱亲和纯化，获得带标签的野生型和突变型HSP90融合蛋白，再通过标签蛋白酶酶解，将标签与HSP90分离，再进行Ni柱亲和纯化，去除残留的带标签融合蛋白、融合标签以及标签蛋白酶，最终获得高纯度的野生型和突变型HSP90蛋白。 （七）等温滴定量热技术 （八）细胞转染 （九）免疫共沉淀（Co-IP） （十）统计分析 结果: 在第一部分，雷公藤红素对不同白血病细胞增殖和抑制HSP90的影响研究中，发现，雷公藤红素对研究中常用到的六种白血病细胞株增殖均有抑制作用，且表现出剂量依赖性；但对每种白血病细胞株增殖的抑制程度有所不同。选择了三种对雷公藤红素增殖抑制作用较明显的白血病细胞株，U937、NB4和THP-1，观察雷公藤红素对它们热休克反应的诱导（HSP90抑制的标志性反应）情况后发现，这3种白血病细胞，在经雷公藤红素处理后，均发生明显的热休克反应，表现为HSP70表达显著升高，结合项目组既往发现的雷公藤红素处理后HSP90客户蛋白Cdk4、Cdc37等水平下降，说明细胞内出现HSP90抑制。但HSP90和HSP40的表达水平，没有明显变化。表明雷公藤红素抑制白血病细胞增殖可能是通过抑制HSP90功能，而非改变HSP90蛋白表达量来实现。 在第二部分，雷公藤红素与HSP90结合的生物信息学研究中，意外的发现，在无核酸结合状态的HSP90二聚体中可能存在一个雷公藤红素结合口袋，这个口袋 由HSP90二聚体的两个单体共同组成，分别是一个HSP90单体上His490、Tyr493、Val530、Gln531、Thr540、Val542、Lys546、Gly548，和另一个HSP90单体上Lys582、Thr683。而雷公藤红素通过其结构中的羧基端与HSP90上的氨基酸形成强作用力的盐桥。 为证实生物信息学预测结果，在第三和第四部分中，分别对雷公藤红素和HSP90上的关键结合基团进行改变，加以研究。 在第三部分研究中，用含三个甘氨酸的短肽取代雷公藤红素羧基端的羟基，结果发现，雷公藤红素原有的抑制白血病细胞增殖和诱导热休克反应的效果都消失。 在第四部分研究中，对HSP90上两个关键结合氨基酸基团，Tyr493和Lys546，进行突变，研究这两个关键基团对雷公藤红素与HSP90直接结合，和对HSP90复合体中客户蛋白结合的影响。通过ITC实验，观察了雷公藤红素与HSP90蛋白结合情况，结果发现，雷公藤红素能直接结合非突变HSP90蛋白，而突变了关键结合氨基酸位点后，雷公藤红素不能结合突变HSP90蛋白。还发现，雷公藤红素结合HSP90蛋白的能力强于经典HSP90抑制剂17-AAG。用免疫共沉淀方法，将HSP90蛋白复合体提出后经雷公藤红素处理，发现，雷公藤红素明显降低野生型HSP90复合体中的Cdc37、Cdk4和HSP70，但在突变型HSP90复合物中，这种作用消失了。并且，还意外的发现，HSP90突变后与Cdc37的结合能力显著降低，但保留了与Cdk4和HSP70结合能力。表明HSP90上这两个氨基酸位点对与Cdc37结合可能也很重要。 结论: 白血病的靶向治疗需要寻找新策略，HSP90可能参与了各种类型的白血病发生发展过程。中药提取物雷公藤红素具有治疗白血病药理作用，且被证实为一种新的HSP90抑制剂。课题组前期研究和他人研究都发现，雷公藤红素能抑制白血病细胞增殖，可能与其抑制HSP90有关。 本课题对雷公藤红素通过抑制HSP90，影响白血病细胞增殖的分子和结构机制进行了研究。运用细胞生物学、分子生物学、生物热力学等方法，首次证实，雷公藤红素能与HSP90直接结合，且发现HSP90上两个氨基酸基团和雷公藤红素羧基端分别在雷公藤红素抑制HSP90，进而抑制白血病细胞增殖中起关键性作用。 本课题研究成果为雷公藤红素治疗白血病提供了更坚实的理论基础，为雷公藤红素药理机制研究和药物改造提供了理论依据，也为雷公藤红素的临床应用奠定了基础。

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