碳纳米材料治疗开放骨折后感染性骨缺损及伤口疤痕的研究

摘要

随着我国工业及交通的高速发展，交通事故、高处坠落等高能量损伤导致的开放性骨折发病率逐年升高，而开放性骨折后易发生骨感染。针对感染性骨缺损的一系列病理特点，学者们主要将其归纳为以下几个方面1）细菌生物膜形成;2）抗生素在局部难以形成有效浓度;3）局部血运破坏;4）骨质再生困难。所以开发具有抗菌及成骨双重效能的植骨材料对于治疗开放性骨折导致的感染性骨缺损十分重要。另一个影响开放性骨折患者预后的并发症是伤口疤痕。高能量损伤导致的开放性骨折中，局部软组织受损严重，伤口不规则;即使开放性骨折患者的骨组织能在较长的治疗周期内愈合，但是如果遗留明显的疤痕组织，会对患者日常生活造成困扰，限制关节的活动度，降低开放性骨折患者术后的满意度。防止瘢痕形成的关键包括以下几个方面:抑制成纤维细胞过度增殖，抑制胶原的过度沉积，促进伤口部位的纤维组织有序生长。然而现阶段的治疗手段在减少增生性瘢痕形成的效果上尚不尽人意。
　　根据开放性骨折感染及骨缺损的治疗需求，碳纳米材料中的石墨烯作为植骨材料的优越性体现在以下方面:1、改良支架的理化性能，满足骨填充需要;2、生物相容性及其促骨形成性能优良;3、对干细胞增殖和成骨分化具有积极影响;4、材料本身具备一定的抗菌性能;5、具备特殊的结构特点可作为理想的药物载体。
　　另一方面，碳纳米管作为碳纳米材料的另一种存在形式，因其独特的结构和丰富的表面可修饰性，已经广泛运用于生物医学领域。研究已发现有序排列的碳纳米管可诱导多种细胞取向性生长生长。表明取向性的碳纳米管(ACNTs)作为组织工程支架，可控制细胞生长的位置和方向。
　　本研究的目的旨在利用碳纳米材料独特的理化性质，制备成骨性能良好且本身具备一定抗菌性能的三维复合支架，并搭载抗生素，用于开放性骨折后感染及骨缺的治疗;再者，利用碳纳米材料优良的可塑性，制备取向性的碳纳米管薄膜，通过实验研究明确其抑制瘢痕形成的效应，并探究其机理，为碳纳米材料在组织工程中的进一步应用提供新的思路。
　　我们通过自组装的方法，以抗坏血酸为还原剂，合成还原型氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石复合支架(RGO-nHA)，通过SEM，AFM，TEM观察其微观表征;通过TGA，FTIR等手段表征其理化性质;通过药物体外释放实验测定复合支架缓释万古霉素的性能;选用L929、MC3T3细胞，评估支架对其单克隆形成和凋亡的影响;选用BMSCs细胞，通过细胞计数、荧光染色、SEM及CLSM等方法评估支架对细胞粘附增殖，细胞形态的影响;通过茜素红染色，ALP活性检测等手段评估载药支架的成骨性能;通过平板菌落计数，荧光染色等手段评估支架抑制细菌增殖及生物膜形成的情况;通过液体培养基和固体培养基抑菌圈实验评估支架的抗菌性能及其持久性;通过体外溶血实验，评估支架的血液相容性，并通过SEM观察红细胞形态变化;通过将复合支架植入小鼠皮下，观察其在体内吸收的情况，评估其对小鼠关键脏器的影响;建立新西兰大白兔感染性骨缺损模型，将复合支架分组植入新西兰大白兔模型局部病灶内，通过影像学检测、血生化、以及组织学检测评估感染控制和骨再生情况。
　　另外，我们通过化学气相沉积法制备有序性的碳纳米管阵列，制备成ACNTs薄膜，通过SEM，TEM，SAXRD等方法观察其微观形貌并评估其有序性;通过细胞增殖实验、EdU染色及细胞凋亡实验评估其对细胞增殖的影响及其细胞安全性;通过荧光染色和SEM观察ACNTs诱导细胞骨架重配并定向生长的情况;通过基因芯片分析，PCR、Western-blot等方法研究其抑制胶原沉积、抑制细胞增殖、诱导细胞定向生长的机制;运用新西兰大白兔增生性瘢痕模型，通过大体观察、组织学分析等方法验证ACNTs抑制增生性瘢痕形成的效果。
　　结果表明，所制备的RGO-nHA复合支架具备相互连通的三维多孔结构，掺入nHA后成骨性能也得到增强，可促进细胞长入、促进骨质再生;在此复合支架上负载万古霉素之后，由于与石墨烯的π-π键合，药物可以在初始阶段实现较快速的释放，然后进行缓慢的药物释放，该药物缓释特点与石墨烯的固有的抗菌活性相结合之后可确保快速治疗感染并提供对细菌的持久抑制作用。体内实验也证明该载药系统可有效治疗感染性骨缺损。再者，我们通过化学气相沉积法成功合成了ACNTs，结果表明ACNTs可有效抑制成纤维细胞的过度增殖，引导细胞的取向性生长，抑制胶原沉积，而且体外实验结果证实其无细胞细胞毒性。机制分析表明，ACNTs主要通过改变细胞增殖，细胞骨架、细胞运动性以及胶原分泌相关基因表达而起作用。最后，我们采用兔耳疤痕模型对其活体效应进行了评估，表明ACNTs可有效抑制增生性疤痕的形成。
　　以上研究利用石墨烯、碳纳米管两种碳纳米材料独特的理化及生物特性，创新性地将其引入开放性骨折导致的感染性骨缺损及伤口疤痕的治疗中，通过系列体外及动物活体实验证明碳纳米材料可作为治疗感染性骨缺损和伤口疤痕的理想组织工程支架，这为利用新型的碳纳米材料解决临床难题提供了新的思路。

目录

声明

摘要

主要符号对照表

第一章 绪论

一、碳纳米材料的主要种类

二、碳纳米材料在组织工程中的运用

三、碳纳米材料在药物载体中的运用

四、碳纳米材料的抗菌性能

五、本课题的研究目的与内容

第二章 载万古霉素还原型氧化石墨烯／纳米羟基磷灰石复合支架的制备及其理化、生物性能研究

一、引言

二、材料与方法

三、结果及讨论

四、结论

第三章 载万古霉素还原型氧化石墨烯／纳米羟基磷灰石复合支架体内安全性及修复感染性骨缺损的效能评估

一、引言

二、材料与方法

三、结果及讨论

四、结论

第四章 取向性碳纳米管抑制增生性疤痕形成的基础研究

一、引言

二、实验材料及方法

三、实验结果及讨论

四、结论

综述 石墨烯材料在生物医学工程中的应用研究进展

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢