解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)在哮喘气道重塑中的作用研究

摘要

本文主要分为以下几个部分: 第一部分:哮喘患者血清ADAM33的表达水平及其与哮喘严重程度、气流受限和气道慢性炎症的关系 目的:通过检测不同严重程度哮喘患者血清中ADAM33的表达水平，并将其与肺功能FEV1%以及气道炎症指标IL-4、IL-13、TGF-β1、血清总IgE和外周血嗜酸性粒细胞（Eosinohphils,Eos）计数并进行相关性分析，初步评估ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。 方法:纳入2015年5月至2016年5月期间于本院就诊的轻-中度哮喘、重度哮喘和健康对照组患者，分别检测肺功能FEV1%和血清中ADAM33的表达水平和血总IgE水平、Eos计数、IL-4、IL-13和TGF-β1的表达水平并进行相关性分析。 结果:重度哮喘组、轻-中度哮喘组和健康对照组血清中ADAM33表达分别为64.8±12.8pg/mL、23.8±6.21pg/mL和18.3±4.49pg/mL，重度哮喘组和轻-中度哮喘组血清ADAM33表达均显著高于健康对照组，且重度哮喘组血清ADAM33表达也同样高于轻-中度哮喘组（均p＜0.05），差别有统计学意义。与Pearson直线相关分析显示ADAM33表达与FEV1%呈负相关，与IL-4、IL-13和TGF-β1水平呈正相关性，而与Eos计数和血清总IgE无相关性。 结论:重度哮喘患者外周血清中ADAM33表达上调，且表达水平与哮喘严重程度成正比。相关性分析显示哮喘外周血ADAM33表达水平与IgE、Eos粒细胞计数无明显关系，与肺功能FEV1%呈负相关，与IL-4、IL-13和TGF-β1水平呈正相关，提示血清ADAM33可能参与哮喘的气道重塑过程。 第二部分:HDM对16-HEB细胞中ADAM33表达和上皮细胞-间质转化的影响 目的:以屋尘螨提取液（House dust mite extracts,HDM）刺激人支气管上皮细胞16-HBE，通过检测过敏原对16-HBE细胞中ADAM33表达水平以及上皮细胞-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)改变的影响，评估过敏原哮喘中ADAM33表达与气道重塑中EMT的关系。 方法:16-HBE细胞分为HDM（10ng/mL）组，TGF-β1（10ng/mL）组、HDM+TGF-β1（各10ng/mL）组和阴性对照（含1%FCS的DMEM培养液）组。培养72h后200×光镜下观察细胞形态，CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，Western blot法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）；波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。 结果:HDM单独不能刺激16-HBE细胞增殖和发生纤维样细胞形态改变，对EMT相关蛋白Vimentin和α-SMA的表达无明显影响，但减少了E-cadherin蛋白的表达而降低细胞间粘附。HDM与TGF-β1共同作用则明显促进了16-HBE细胞增殖和发生纤维样细胞形态改变，减少了E-cadherin蛋白，增加了Vimentin和α-SMA的表达。 结论:HDM单独能通过减少16-HBE细胞表达E-cadherin而减低细胞间粘附力，并不能诱导发生EMT改变；与TGF-β1共同作用则明显促进TGF-β1诱导的16-HBE细胞EMT改变。 第三部分:TGF-β1对16-HBE细胞中ADAM33表达的影响及其与TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化的关系研究 目的:观察TGF-β1对人气道上皮细胞（16-HBE）中ADAM33表达的影响，以及ADAM33表达水平与TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化（EMT）的关系，探索ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。 方法:以不同浓度的TGF-β1（10、20和30ng/mL）刺激后观察细胞形态变化，Western Blot和RT-PCR法检测ADAM33和EMT相关蛋白（E-cadherin和Vimentin）和mRNA表达变化。 结果:不同浓度的TGF-β1均可刺激16-HBE细胞由椭圆形贴壁形态转化成纺锤体型的成纤维细胞样形态改变，在浓度为20ng/mL时即达到最明显。不同浓度的TGF-β1均上调ADAM33和Vimentin蛋白和mRNA表达，下调E-cadherin表达，且ADAM33蛋白表达与E-cadhein呈显著的负相关（R2=0.935，P＜0.05），而与Vimentin呈正相关（R2=0.425，P＜0.05）。 结论:TGF-β1可能通过促进16-HBE细胞表达ADAM33而促进哮喘气道重塑中的上皮细胞-间质转化改变。 第四部分:气道上皮细胞过表达ADAM33对TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化的影响 目的:通过构建Ad-ADAM33腺病毒载体转染16-HBE细胞，观察ADAM33表达水平上调对TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化（EMT）的影响，探索ADAM33参与哮喘气道重塑的可能机制。 方法:构建Ad-ADAM33腺病毒载体，筛选最佳MOI值转染16-HBE细胞，将细胞分为空白对照组(不转染腺病毒)，阴性对照组（转染空病毒）和阳性表达组（转染Ad-ADAM33重组腺病毒），以20ng/mL浓度的TGF-β1刺激24、48和72h后分别通过Western blot和RT-PCR法检测EMT相关蛋白（E-cadherin和Vimentin）和mRNA表达变化。 结果:成功构建Ad-ADAM33腺病毒，筛选转染最佳MOI值为1500，转染16-HBE细胞后western blot检测ADAM33蛋白表达明显升高。以20ng/mL浓度的TGF-β1刺激24、48和72h后，RT-PCR检测发现于三个时间段阴性对照组细胞E-cadherin和Vimentin mRNA表达较空白对照组无明显变化，差异无统计学意义（均p＜0.05），但Ad-ADAM33-EGFP组细胞E-cadherin mRNA表达较空白对照组和阴性对照组明显降低，而Vimentin mRNA明显升高，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。在western blot检测发现Ad-ADAM33-EGFP组细胞E-cadherin蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显降低，Vimentin蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（均p＜0.05）。 结论:人支气管上皮细胞中ADAM33的表达上调可以促进TGF-β1诱导的上皮细胞-间质转化改变。