HGF基因突变在青少年特发性脊柱侧凸发病中的作用和机制研究

摘要

青少年特发性脊柱侧凸（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是青春期前后最常见的脊柱侧凸畸形，主要表现为冠状面上向侧方弯曲同时伴椎体旋转，矢状面上生理性前凸或后凸的增加或减少，是一种复杂的三维结构的脊柱畸形。该疾患不仅影响患儿的外形，畸形的外观同时会给患儿造成严重的心理障碍。此外，AIS患儿可因功能障碍或长期存在的腰背痛影响其生活质量，严重者可因心肺功能衰竭而导致死亡。以侧凸Cobb角＞10°为诊断标准，AIS的发病率约为1.5%～3%，其中每年接受支具治疗的患者约为30000人，每年接受手术治疗的患者约为13000人。AIS临床危害严重，但至今病因不明，缺乏有效的方法预测疾病的进展情况，这就给早期治疗带来了困难。因此，研究AIS的病因，建立有效的预防和治疗方法对于该病的诊治意义非凡。 近年来由于低成本高通量基因测序技术平台的迅速发展，AIS的遗传学研究有明显升高的趋势，并取得了一定的成绩。既往AIS的基因遗传变异研究主要包括连锁分析、候选基因和全基因组关联分析（GWAS）3种，这些研究发现的遗传标记存在重复性较差、阳性位点功能意义不清等缺点。因此，无法为AIS的诊断、治疗以及预防提供更有效的帮助。罕见突变是指普通人群中最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）小于1%的突变，越来越多的学者认为罕见突变在遗传病的发生、发展中可能发挥着更大的作用。最近的研究报道通过全外显子组测序技术（whole-exome sequencing，WES）发现AKAP2，POC5，HSPG2等基因的罕见突变可能与AIS的发生相关，其中斑马鱼体内表达突变型POC5mRNAs后可导致脊柱侧凸。Buchan等对91例严重侧凸AIS患者进行WES测序，发现携带有FBN1与FBN2罕见突变的AIS患者脊柱侧凸的角度较其他AIS患者平均要大15°。这为我们的遗传学研究提供了新的思路和方法。 本研究在前期收集的一个AIS家系的基础上，利用全基因组测序技术（whole-genome sequencing，WGS）对家系中四名成员进行测序，按照常染色体显性遗传模式进行分析，兼顾突变基因的功能，对得到的测序结果进行筛选，最终认定肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因突变是导致该家系AIS发生的病因。后续对100例散发AIS病例进行WES，发现1例存在家系中HGF突变。此外，还有1例存在HGFAC（HGF activator）的突变，1例含有HGF/c-met突变。通过蛋白形态模拟及分子、细胞生物学实验探寻HGF基因突变对基因及蛋白功能的影响。建立斑马鱼HGF基因沉默动物模型，观察到斑马鱼存在脊柱侧凸的表型。以上的研究证实HGF在AIS发病中发挥重要的作用，为AIS的临床诊断、预后判断和治疗选择提供了理论基础及新的思路。 目的： AIS是一种常见的病因不明的脊柱畸形，遗传因素在其发病中占重要地位。本研究通过对成显性遗传的AIS家系进行全基因组测序、一代测序基因型与表型共分离验证以及全外显子测序验证100例散发病例,发现HGF基因可能是一个新发的汉族AIS的致病基因。后期在分子、细胞水平及构建动物模型进一步验证HGF基因突变在AIS发病中的作用，为从病因学上早期诊断及预防该疾病提供一个新的思路及理论基础。 方法： 通过WGS技术对临床收集的1个AIS家系中4名成员（患者Ⅱ∶2、Ⅱ∶3、Ⅲ∶1以及对照Ⅱ∶1）进行测序，并按照常染色体显性遗传模式、是否改变氨基酸及蛋白功能及危害性预测进行分析，对得到的结果进行筛选。同时通过一代测序对家族成员和130例对照进行基因型与表型共分离的验证，最终认定HGF基因突变可能是导致该家系AIS发病的原因。后期通过WES技术对100例临床收集的散发AIS病例进行测序、验证；采用计算机蛋白三维结构模拟预测和评估HGF基因突变（c.C1787T,p.T596M）对蛋白结构、氨基酸相互作用的影响，并构建含野生型和突变型HGF基因质粒，转染细胞，采用western blotting技术检测蛋白在细胞中的表达水平，采用ELISA技术检测分泌到细胞上清液中的蛋白含量；选择野生型AB品系斑马鱼为实验动物，通过MOs基因沉默技术抑制与人HGF基因同源的斑马鱼HGFA基因，观察斑马鱼脊柱发育的情况。 结果： 对全基因组测序结果按如下方法进行筛选：①患者中所有的非同义突变；②患者中共有的突变；③患者中有，对照家系成员中没有的突变；④新发的罕见突变；⑤软件预测对蛋白功能影响大的突变，最后筛选出3个变异体：HGF（c.C1787T,p.T596M），PDHA2(c.G479C,p.G160A)以及ACOT4(c.G503A,p.G168E)。通过一代测序进行基因型与表型共分离验证，发现只有HGF（c.C1787T,p.T596M）位点在这个AIS家系中是完全基因型与表型共分离。后期100例散发AIS病例进行全外显子测序，发现1例含有HGF（c.A920C,p.Q307P）突变，1例含有HGFAC（HGF activator）突变,1例含有HGF/c-met突变。利用计算机蛋白三维结构模拟预测突变后HGF结构发现HGF（c.C1787T,p.T596M）蛋白结构更加稳定，western blotting及ELISA检测发现其分泌到胞外的能力降低。最后利用MOs基因沉默技术构建斑马鱼模型，在斑马鱼中观察到了AIS的表型。 结论： 利用全基因组测序寻找家系中的致病基因是一种有效的方法。HGF基因突变是导致AIS的病因。该基因的突变影响了HGF的胞外分泌功能，可能造成脊柱椎旁肌发育不平衡，而导致脊柱侧凸的发生。

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