LIM矿化蛋白-1对脊柱韧带骨化作用的实验研究

摘要

脊柱韧带组织一般由成纤维细胞构成，成纤维细胞能分泌胶原及粘多糖等一些物质。脊柱韧带组织在生理状态下呈一种动态与静态平衡，一般不会向骨化方向进展。但在某些因子刺激下，成纤维细胞具有向成骨细胞分化的能力，并具有成骨细胞分泌功能。LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein1，LMP-1)是一种细胞内的非分泌蛋白，在胚胎骨发育及骨细胞的分化过程中起着重要作用，是一种正调节因子，其表达量的改变能影响骨细胞的生长及分化，与异位成骨等多种骨性疾病有着密切的联系。研究显示:LMP-1可由多种细胞分泌，为细胞内信号转导分子，其直接作用于细胞核，启动相关基因片段发挥生物学作用。根据胚胎细胞分化及发育研究表明，骨组织与牙本质具有相同的起源，LMP-1在骨组织和牙本质的细胞分化、细胞外基质的分泌和矿化过程中有重要的作用，与成骨及牙本质骨化等过程密切相关。LMP-1可能对骨形态发生蛋白(BMPs)及Runx2具有调控作用，在骨化及异位成骨具有重要的作用，但其调控机制尚不明了。本课题采用免疫组织化学染色及RT-PCR技术测定LMP-1及mRNA在颈椎后纵韧带中的表达水平，探索LMP-1对成骨调控作用的分子生物学机制。
　　目的:
　　1、分析颈椎后纵韧带骨化患者与非颈椎后纵韧带骨化患者的后纵韧带中LMP-1水平表达差异，探讨LMP-1对韧带骨化调控作用的分子生物学机制;
　　2、检测LMP-1在脊柱韧带组织中原位分布情况，探讨LMP-1在脊柱韧带骨化病中的发病机制。
　　方法:
　　1、标本的选取:根据患者的临床症状、影像学检查证明为颈椎后纵韧带骨化患者16例标本作为实验组;以脊髓外伤或术前影像学证明非骨化手术入路切取的颈椎后纵韧带患者20例标本为对照组。
　　2、应用RT-PCR技术对实验组16例OPLL标本及对照组20例非OPLL标本行mRNA检测，每个标本以待测基因与内参基因灰度值的比值为计算参数，所有数据采用均数±标准差（(x)±s）表示，两组数据问采用独立样本t检验，应用SPSS19.0软件对所得数据进行统计学分析。
　　3、运用免疫组织化学染色方法对两者标本进行染色，以抗LMP-1单抗为一抗，以SABC法为实验步骤，DAB显色，显微镜下观察标本颗粒有无情况，IPP6.0图像分析软件测定Tryptase的表达。每张切片电镜下放大200倍，随机取3～5个测量视野，测量后纵韧带Tryptase平均光密度值(OD)，然后取其平均值。所有数据采用均数±标准差（(x)±s）表示，两组数据间采用独立样本t检验，应用SPSS19.0软件对所得数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1、LMP-1在颈椎后纵韧带骨化组及非颈椎后纵韧带骨化组中均有表达;
　　2、LMP-1在颈椎后纵韧带骨化组中表达量高于非颈椎后纵韧带骨化组，且差异具有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论:
　　通过生物分子学技术及形态学分析，LMP-1在颈椎后纵韧带骨化发病过程中起着重要的作用。

目录

摘要

符号说明

前言

实验一：RT-PCR技术

1、材料与试剂

2、方法

3、结果

实验二：免疫组织化学染色

1、材料与试剂

2、方法

3、结果

讨论

结论

全文小结

附图

参考文献

综述 脊柱后纵韧带骨化发病机制的分子生物学研究进展

致谢

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