马铃薯Y病毒N株系HC-Pro基因在毕赤酵母中分泌表达与鉴定及抗血清制备

摘要

马铃薯Y病毒属成员是植物病毒中最大的被蚜虫以非持久方式传播的群体，马铃薯Y属病毒HC-Pro蛋白为病毒自身编码，在病毒生活史中体现出了多种不同功能。与很多已经鉴定出HC-Pro功能不同的是，在蚜虫传毒研究中必须使用具有生物活性HC-Pro蛋白的参与。因此本文我们采用毕赤酵母表达系统来获得具有生物活性的HC-Pro蛋白。 采用基因工程技术构建酵母表达系统的重组表达质粒。将重组质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)以此表达目的蛋白，并对表达蛋白进行鉴定。根据马铃薯Y病毒HC-Pro发表序列，设计1对引物。利用RT-PCR的方法，以感病植物叶片提取的RNA为模板，扩增此基因。所得的DNA片段经SnaBI和EcoRI双酶切后用T4DNA连接酶与pPIC9K载体进行连接，然后导入大肠杆菌DH5a，用PCR法筛选阳性转化子，并用双酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。重组质粒线性化后，用电击法将重组质粒转化入巴氏毕赤酵母，在缺组氨酸的MD板上筛选阳性菌落，然后用不同浓度的G418-YPD板筛选多拷贝插入单菌落。培养多拷贝插入的酵母细胞，用甲醇诱导目的蛋白的分泌，SDS-PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白，免疫家兔制备抗血清。 PCR扩增出两端带有SnaBI和EcoRI酶切位点的目的基因片段。目的基因经双酶切后连接载体pPIC9K，然后导入大肠杆菌DH5a中，在含氨卞青霉素(AMP)的卡那霉素(Kan)LB板上用PCR反应筛选出阳性菌落，双酶切结果表明目的基因已插入载体中，且方向正确，测序结果进一步证明马铃薯Y病毒HC-Pro基因表达质粒成功地克隆了目的基因片段。重组质粒转化巴氏毕赤酵母，G418筛选出多拷贝插入的单克隆，多拷贝插入的单克隆酵母细胞经摇瓶发酵和1％甲醇诱导后，SDS-PAGE检测发酵液上清，在66KD处有一特异条带表达，目的条带蛋白占上清液总蛋白的40％。纯化后的HC-Pro蛋白免疫家兔，获得了效价为1：256的高价血清。Westernblot鉴定表明，表达蛋白可以和兔抗HC多抗发生结合反应。

目录

文摘

英文文摘

研究生学位论文的独创性声明、导师指导研究生学位论文的承诺、关于其他单位与人员对研究生学位论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章试验材料和方法

第三章结果与分析

第四章结论与讨论

参考文献

致谢

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