普那菊苣高频再生体系建立和遗传转化研究

摘要

普那菊苣(PunaChicory)原产于欧洲，为菊科多年生宿根草本植物，国外广泛用于饲料、制糖等原料。普那菊苣适应性广，根系发达，产草量高，营养丰富，粗蛋白质16.44％～27.35％，饲用价值高。通过饲喂多种家畜和家禽，发现普那菊苣是一种适口性极好的牧草。我国80年代从新西兰引进，从几年的试验情况来看，其适应性强，适口性很好，抗病虫能力强，深受广大用户欢迎，是一种很有推广价值的牧草。目前国内外普那菊苣相关研究多集中在高产栽培技术方面，而有关普那菊苣组织培养和基因转化方面的研究报道较少。 本研究以采自试验田的叶片为实验材料，经0.1％的升汞消毒处理后接种于含不同激素浓度配比的MS培养基上进行愈伤组织的诱导和芽的分化以及根的再生。分析了不同激素配比和不同激素浓度对愈伤组织诱导和芽分化以及根再生效果的影响。结果表明6-BA+IBA是普那菊苣理想的愈伤组织诱导和芽分化诱导激素组合，MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基较适合愈伤组织的诱导和丛生芽的生成，并且在愈伤诱导速度上要快于其它筛选培养基，单个外植体丛生芽的分化个数也要多于其它筛选培养基。在根的再生诱导过程中，1/2MS培养基要明显优于其它筛选培养基，活性炭对于普那菊苣根的再生没有明显的促进作用。 以植物表达载体pBI121为基本框架构建植物表达载体pBI121-gfp。用BamhⅠ和SacⅠ分别双酶切载体pBI121和pUC18(含绿色荧光蛋白基因)，回收pBI121大片段和绿色荧光蛋白基因片段，过夜连接，转化筛选得到阳性克隆，经特异引物PCR和酶切检测，证明绿色荧光蛋白基因已经替换GUS基因，连接到载体pBI121上。 以已经建立起来的再生体系为基础，以农杆菌LBA4404(含质粒pBI121-gfp)和EHA105(含质粒pBI121-gfp)为介导侵染转化普那菊苣，探索普那菊苣高效遗传转化体系。结果表明：外植体适宜的预培养时间为3-4天，与农杆菌的共培养的时间控制在3-4天；农杆菌侵染的适宜浓度为0D600=0.4-0.6，侵染时间控制在5min左右；脱菌选择羧苄青霉素，适宜的脱菌浓度为350mg/L；卡那霉素阳性筛选的适宜选择浓度为40mg/L。

目录

文摘

英文文摘

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第一章文献综述

第二章普那菊苣高频再生体系的建立

第三章表达载体pBI121-gfp构建

第四章普那菊苣遗传转化研究

第五章结论和创新

参考文献

附录:缩略词表

致谢

作者简介