苹果遗传转化受体系统的优化与APX基因的瞬时表达

摘要

苹果(Malus domestica)是落叶果树中主要栽培的树种之一，通过常规杂交育种对其改良十分困难。因此，采用基因转移技术获得转基因植株已作为苹果育种的重要手段。苹果叶片是进行基因转移较理想的受体材料。但由于苹果叶片再生频率及转化效率较低，限制了苹果转基因技术的发展与应用。 抗坏血酸过氧化物酶(APX)在循环利用抗坏血酸、保护细胞组分抵御氧化损伤中发挥重要的作用。通过基因工程的方法提高植物中APX的活性，对增加植物活性氧清除能力，因而对提高植物的抗氧化胁迫的能力具有重要意义。 本试验通过研究影响再生的因素，优化了嘎拉和长富2号叶片再生体系；通过抗坏血酸过氧化物酶基因瞬时表达的研究，采用叶盘法转化受体材料，建立和优化了嘎拉和长富2号叶片遗传转化体系，为苹果的转基因研究奠定基础。 主要研究结果如下： 1．获得了高效的苹果离体叶片再生体系通过调整植物生长调节剂种类及浓度、不同部位叶片、叶片极性和暗培养时间等因素，确立了嘎拉和长富2号叶片再生体系，发现在分别含TDZ 0.5 mg·L<'-1>+NAA0.4 mg·L<'->和TDZ 4.0 mg·L<'-1>+NAA0.6 mg·L<'-1>的MS培养基上，以嘎拉叶片近轴面和长富2号远轴面接触培养基，经过21d的暗培养，嘎拉和长富2号叶片再生频率分别达到100％和67％。 2．通过APX基因瞬时表达建立和优化了苹果的遗传转化体系优化了抗生素筛选浓度，通过APX基因瞬时表达，调整农杆菌浸染过程中的多个因素如预培养时间、农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间和选择方法，建立了农杆菌介导的苹果遗传转化体系。确定了2d的预培养、3d的共培养、OD<,600>为0.4和5min的浸染时间有较高的gus/gfp基因表达率，采用延迟选择培养，有利于苹果的遗传转化。

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第一章文献综述

1.1苹果受体系统的建立

1.1.1苹果再生供体

1.1.2影响苹果叶片再生体系建立的因素

1.2果树遗传转化的研究进展

1.2.1转基因改进的果树性状

1.2.2遗传转化技术

1.2.3受体系统

1.2.4选择标记基因和报告基因

1.2.5存在问题及前景展望

1.3转化外源基因的瞬时表达

1.3.1外源基因瞬时表达过程

1.3.2外源基因瞬时表达的应用

1.4植物活性氧清除系统和抗坏血酸及其相关酶的研究进展

1.4.1植物活性氧清除系统及转基因植株的研究

1.4.2植物抗坏血酸的研究

1.4.3植物抗坏血酸过氧化物酶的研究

1.5本试验的目的和意义

第二章材料与方法

2.1植物材料

2.2培养基的配置

2.3试管苗扩繁培养

2.4苹果叶片离体再生

2.4.1生长调节剂对苹果叶片再生的影响

2.4.2叶片成熟度对苹果叶片再生的影响

2.4.3暗培养时间对苹果叶片再生的影响

2.4.4叶片极性对苹果叶片再生的影响

2.4.5 Ag+对苹果叶片再生的影响

2.5受体系统的建立和条件优化与瞬时表达

2.5.1主要培养基

2.5.2试验菌株

2.5.3抗生素敏感性试验

2.5.4农杆菌菌液的制备及浸染

2.5.5菌液浓度的确定

2.5.6浸染时间的确定

2.5.7共培养时间的确定

2.5.8 APX基因瞬时表达的检测

2.6培养条件和试验结果处理

第三章结果与分析

3.1苹果叶片离体再生

3.1.1苹果叶片离体再生的生物学观察

3.1.2生长调节剂对叶片再生的影响

3.1.3叶片成熟度对苹果叶片再生的影响

3.1.4 暗培养时间对苹果叶片再生的影响

3.1.5叶片极性对苹果叶片再生的影响

3.1.6 Ag+对苹果叶片再生的影响

3.1.7再生不定芽的生根

3.1.8试管苗和叶片再生的玻璃化现象

3.2受体系统的建立和优化与瞬时表达

3.2.1 Km对苹果叶片再生的影响

3.2.2 Cef对苹果叶片再生的影响

3.2.3抗生素对苹果试管苗生根的影响

3.2.4预培养时间对转化的影响

3.2.5菌液浓度的确定

3.2.6浸染时间的确定

3.2.7共培养时间的确定

第四章讨论

4.1苹果离体叶片再生的优化

4.2苹果转化条件的优化

4.3 APX外源基因的瞬时表达

第五章结论

参考文献

图 版

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