家蚕微孢子虫（浙江）α、β微管蛋白部分基因的克隆及系统发育分析

摘要

基于微孢子虫分类学地位的争议，本研究通过克隆家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的α-Tubulin、β-Tubulin基因，利用Bioeditor将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，并从NCBI中收集不同物种的α-Tubulin、β-Tubulin基因，用CLUSTALX(1.81)、Mega2以及在线生物信息学软件CLUSTALW(1.83)分析序列并构建系统发育树。结果显示，将测序所得的1202bp和1161bp的两个序列在NCBI上进行blastn比较，大小为1202bp的目的基因与GenBank已经发表的Nosema bombycis(台湾)α-Tubulin同源性为99％，共有5个碱基发生突变，其中靠近5’端的3个突变碱基造成3个氨基酸序列的改变，与其它Nosema属微孢子虫的α-Tubulin的同源性为96％～98％，确定该目的片段为家蚕微孢子虫α-Tubulin，序列登录GenBank(Assension No．EF051590)；大小为1161bp目的基因与GenBank已经发表的Nosema bombycis(台湾)β-Tubulin同源性为98％，共有14个碱基发生突变，靠近3’的4个碱基的改变造成4处氨基酸序列的改变，与其它Nosema属微孢子虫的β-Tubulin同源性为96～98％，确定该目的基因为家蚕微孢子虫β-Tubulin，结果登录GenBank(Assension No．EF151928)。通过浙江株与台湾株的微孢子虫微管蛋白基因比较显示，β-Tubulin的碱基突变率高于α-Tubulin。 构建的系统发育树结果显示，不同基因使用同种方法以及同种基因使用不同方法构建的系统发育树存在某种程度的差别，而得到的一致性结论是微孢子虫以一个独立群位于真菌中，但要具体到与哪个属的真菌更接近，应分别表述为使用α-Tubulin、αβ-Tubulin联合基因构建的系统发育树显示，微孢子虫与接合菌的Entomophaga和Conidiobolus属亲缘关系较近，而使用β-Tubulin构建的系统发育树显示微孢子虫与担子菌和壶菌亲缘关系较近。因此通过对结果的分析认为，对于物种的进化分类研究应建立一套统一的用于系统发育分析的标准体系和方法，且在基因的选择上应结合参与或代表不同生物学功能或性状的多个基因进行综合分析。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章微孢子虫的研究进展

1.1微孢子虫的生物学特征

1.1.1微孢子虫的形态结构特征

1.1.2生活史

1.1.3微孢子虫的二型性

1.2微孢子虫的发芽侵染机理

1.2.1微孢子虫的发芽机理

1.2.2微孢子虫的侵染机理

1.2.3微孢子虫发芽侵染相关因子和抑制微孢子虫发芽相关蛋白的研究

1.3微孢子虫的起源研究

1.4微孢子虫的分类学研究

1.5微孢子虫诊断检测方法的研究

1.5.1透射电镜技术检测

1.5.2光学显微技术检测

1.5.3免疫学技术检测

1.5.4分子生物学技术检测

第二章生物系统发育分析的方法及应用

2.1系统发育分析的流程及方法

2.1.1选择一个相关序列集

2.1.2获得多个序列对位排列

2.1.3构建系统发育树方法的选择

2.2生物系统发育分析的应用

第三章家蚕微孢子虫(浙江)α、β微管蛋白部分基因的克隆及序列同源性分析

3.1材料

3.1.1主要仪器

3.1.2主要试剂的配制

3.1.3实验动物

3.1.4其它试剂

3.2方法

3.2.1新鲜家蚕微孢子虫的繁殖及纯化

3.2.2家蚕微孢子虫基因组DNA的抽提

3.2.3 PCR扩增

3.2.4 PCR扩增产物回收

3.2.5大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

3.2.6 PCR产物的克隆

3.2.7重组质粒的鉴定及测序

3.2.8序列分析

3.3结果与分析

3.3.1家蚕微孢子虫基因组DNA的抽提

3.3.2 PCR扩增结果

3.3.3重组质粒的PCR鉴定结果

3.3.4序列分析结果

3.4讨论

第四章家蚕微孢子虫的系统发育分析

4.1材料

4.1.1生物信息学软件

4.2方法

4.2.1序列收集

4.2.2多重序列比对和系统发育树的构建流程

4.2.3各软件的具体使用方法

4.3结果与分析

4.3.1序列收集结果

4.3.2多重序列比对和系统发育树的构建结果

4.4讨论

4.4.1不同基因同种方法进行系统发育分析的差异

4.4.2同种基因不同方法进行系统发育分析的差异

4.4.3其它

4.5结论

参考文献

附 录

致 谢

个人简历