披碱草（Elymus dahuricus）氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

摘要

氢离子焦磷酸化酶(H+-PPase)是一类H+转运酶，同时它也是以焦磷酸(PPi)为底物的水解酶。H+-PPase水解PPi产生的自由能与H+跨膜转运相藕联，形成质子驱动力，与H+-ATPase一起将细胞质中的H+泵入液泡中，可以建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其他溶质进出液泡提供驱动力，既能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些无机离子(如Na+)对细胞质的毒害；同时，可以使液泡酸化和细胞质碱化，有利于细胞质中生理生化反应的顺利进行。披碱草是禾本科披碱草属多年生优质牧草，具有极强的抗旱、耐盐碱能力。 本研究采用RACE方法，从披碱草中克隆了氢离子焦磷酸化酶基因EdHP1，分析了该基因的生物信息、表达模式和功能鉴定，并确定了氢离子焦磷酸化酶蛋白的亚细胞定位。 (1)克隆了披碱草基因EdHP1的eDNA序列，其序列包括2310 bp的开放读码框架和356 bp 3’非转译区。生物信息学分析表明，该基因编码770个氨基酸；其蛋白含有14个跨膜区，是一个典型的膜蛋白，同时包含三个保守区(CS1、CS2和CS3)。氨基酸同源性比较发现，EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶的同源性大于86％，与大麦焦磷酸化酶的同源性高达98％，可见H+-PPase在高等植物中是高度保守的。 (2)亚细胞定位分析结果显示，EdHP1定位在质膜上。 (3)．EdHP1基因的表达模式分析说明，该基因的表达受干旱、高盐、低温、低磷、低钾以及重金属CA2+,等非生物胁迫的诱导。在干旱、高盐、低磷、低钾条件下，EdHP1基因的表达从1h开始逐渐增强，在24哒到最大；在低温胁迫下，EdHP1表达先增强后减弱，5h表达量最高，12h表达量开始下降：在重金属Cd2+条件下，EdHP1的表达从1h开始逐渐增强，在12h达到最大，24h后有所减弱。 (4)EdHP1基因的功能分析证明，在干旱、高盐、低温、低磷、低钾以及重金属Cd2+等胁迫条件下，转基因烟草生长都明显比野生型烟草好；其地上部分的生长量明显大于野生型对照；根系也明显比野生型对照发达；对烟草中H+-PPase的活性进行测定发现转基因烟草的酶活性明显比野生型对照高。在高盐和重金属Cd2+胁迫条件下，对转基因烟草和野生型对照中的Na+和Cd2+含量进行测定发现，野生型对照中Na+和Cd2+的含量明显比转基因烟草中高，可见EdHP1能将Na2+和Cd2+泵到胞外。而在低磷和低钾条件下，转基因烟草中磷和钾的含量明显比对照高，可见EdHP1能促进转基因烟草对磷和钾元素的吸收。这就证明EdHP1基因不仅能够提高转基因烟草抵御干旱、高盐和重金属Cd2+离子的胁迫的能力，而且促进植物磷和钾元素的吸收。 本研究首次从披碱草中克隆了EdHP1基因，通过亚细胞定位的方法证明了EdHP1是H+-PPase家族中的一个新型质膜蛋白，通过RT-PCR和Northern的方法比较全面的分析了EdHP1基因对非生物胁迫的响应模式，比较系统的对其功能进行了鉴定，明确了质膜型EdHP1的功能。本研究不但丰富了H+-PPase家族，而且为作物抗逆遗传改良提供了新的基因资源，具有一定的理论和实践意义。

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声明

第一章文献综述

1.1植物抗逆相关基因和转录因子

1.1.1渗透调节物质合成酶基因

1.1.2抗氧化系统酶类基因

1.1.3 LEA蛋白基因

1.1.4转录因子基因

1.2植物H+-pyrophosphatase(H+-PPase)研究进展

1.2.1.H+-PPase的属性

1.2.2H+-PPase的分子结构

1.2.3H+-PPase在生物体内的分布

1.2.4H+-PPase酶蛋白的分子量

1.2.5H+-PPase的主要功能

1.2.6焦磷酸酶对逆境的反应

1.2.7 H+-PPase在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用

1.2.8 H+-PPase基因在植物中的遗传转化

1.3研究的目的意义及技术路线

1.3.1研究的目的意义

1.3.2技术路线

第二章披碱草氢离子焦磷酸化酶基因(EdHP1)的克隆与生物信息学分析

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2试验方法

2.2结果

2.2.1 EdHPI基因3'端序列的克隆

2.2.2EdHPI基因5'端序列的克隆

2.2.3 EdHPI基因全长eDNA的克隆

2.2.4 EdHPI全长序列的生物信息学分析

2.3讨论

2.3.1材料的选择

2.3.2几种植物焦磷酸酶编码氨基酸的同源性分析

第三章披碱草氢离子焦磷酸化酶的亚细胞定位和表达模式分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1目标片段的扩增及载体的构建

3.2.2 EdHP1的亚细胞定位

3.2.3 EdHP1基因的表达模式分析

3.3讨论

3.3.1H+-PPase在细胞中的定位

3.3.1H+-PPase的表达模式

第四章EdHP1基因的功能鉴定

4.1材料与方法

4.1.1转基因材料、菌株及试剂

4.1.2方法

4.2结果

4.2.1目标片段的扩增及载体的构建

4.2.2转基因烟草的PCR检测

4.2.3 EdHP1转基因烟草的功能鉴定

4.3讨论

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历