DHAR基因植物表达载体的构建及转化仙客来研究

摘要

抗坏血酸作为一种重要的抗氧化剂，在植物细胞的酶促和非酶促反应中都具有重要意义。脱氢抗坏血酸还原酶以谷胱甘肽为底物，催化脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸，在循环利用抗坏血酸、保护细胞组分抵御氧化损伤中发挥重要的作用。本研究是在获得苹果脱氢抗坏血酸还原酶基因(DHAR)的基础上构建其植物表达载体，并将其转入根癌农杆菌EHA105中，然后通过农杆菌介导法将DHAR基因导入仙客来，并初步探讨了DHAR基因在仙客来中的转化和表达情况，为仙客来抗性品种改良及分子育种奠定基础。 主要研究结果如下： 1.构建了DHAR基因植物表达双元载体pCSB-DHAR并将其导入根癌农杆菌。利用DNA重组技术，将质粒pSB166中包含ED35s-Omega-MCS-UTT-TNOS的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303上，经酶切、电泳鉴定表明，已成功构建了植物中间表达载体pCSB。 双酶切重组质粒pMD18-T-DHAR及中间表达载体pCSB，将DHAR基因片段与线性表达载体pCSB进行定向连接，构建了DHAR基因的植物表达载体pCSB-DHAR，通过酶切、电泳鉴定表明，DHAR基因已成功构建到植物表达质粒中，将此克隆命名为pCSB-DHAR。 采用冻融法，将重组质粒pCSB-DHAR导入农杆菌EHA105中，在含有卡那霉素、链霉素和利福平的平板上筛选阳性克隆，至有单菌落出现，提取质粒DNA，进行双酶切和PCR扩增检测，结果表明重组质粒己导入农杆菌EHA105中。 2.对载体pCSB-DHAR进行Gus基因的瞬时表达检测，确定其具有较理想的转化效率。 用导入重组质粒pCSB．DHAR的农杆菌侵染百合叶片后，对其进行2周的Gus基因瞬时表达检测，结果表明侵染后7d瞬时表达率可达100％，说明载体具有较理想的转化效率。 3.优化了农杆菌介导的以仙客来叶片为受体的遗传转化体系，获得了转DHAR基因仙客来植株。 通过研究DHAR基因转化中影响叶片转化效率的多种因素，确定了各主要影响因素的值。试验结果表明：2d的预培养，OD600值为0.6的工程菌液浓度，侵染时间15min，3d的共培养，延迟筛选两周能获得较高的转化率。2.5mg·L-1到7.5mg·L-1逐步升高的Hyg浓度对仙客来叶片有较好的筛选作用。经抗性筛选获得i54株抗性株系，对其进行PCR检测，有32个株系呈阳性，初步证明DHAR基因已整合到仙客来基因组中。

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第一章文献综述

1.1植物抗坏血酸及脱氢抗坏血酸还原酶研究进展

1.1.1抗坏血酸的生物学功能

1.1.2抗坏血酸还原酶研究进展

1.2植物遗传转化研究进展

1.2.1植物遗传转化的方法

1.2.2转基因植株的检测

1.3仙客来遗传转化研究进展

1.3.1报告基因转化仙客来研究进展

1.3.2仙客来花色基因研究进展

1.3.3仙客来抗性基因研究进展

1.5本研究的目的意义

第二章DHAR基因植物表达双元载体的构建及瞬时表达

2.1试验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2酶及生化试剂

2.1.3 PCR引物

2.2试验内容与方法

2.2.1 DHAR目的基因的获得

2.2.2中间表达载体pCSB的构建

2.2.3 DHAR基因植物表达载体pCSB-DHAR的构建

2.2.4 pCSB-DHAR转化农杆菌EHA105及鉴定

2.2.5植物表达载体pCSB-DHAR的瞬时表达

2.3结果与分析

2.3.1中间表达载体pCSB的构建及鉴定

2.3.2脱氢抗坏血酸还原酶基因植物表达载体的构建

2.3.3根癌农杆菌的转化及鉴定

2.3.4植物表达载体pCSB-DHAR在百合叶片上的瞬时表达

第三章农杆菌介导的DHAR基因转化仙客来研究

3.1材料和方法

3.1.1植物材料

3.1.2试验菌株

3.1.3培养基

3.1.4选择性抗生素敏感性试验

3.1.5根癌农杆菌的活化和抑菌素浓度对农杆菌生长的影响

3.1.6根癌农杆菌介导的仙客来转化

3.1.7抗性植株的再生

3.1.8.PCR检测

3.2结果与分析

3.2.1仙客来叶片潮霉素抗性筛选

3.2.2抑菌素浓度对农杆菌生长的影响

3.2.3预培养对转化效率的影响

3.2.4不同菌液浓度和侵染时间对转化效率的影响

3.2.5共培养对转化效率的影响

3.2.6抗性植株的获得

3.2.7抗性植株PCR鉴定

第四章讨论

4.1 DHAR在AsA-GSH循环中的重要作用及其研究意义

4.2载体构建及瞬时表达

4.3根癌农杆菌介导的仙客来遗传转化有关因素

4.3.1预培养时间对叶片遗传转化的影响

4.3.2共培养时间对叶片遗传转化的影响

4.3.3农杆菌浓度及侵染时间对叶片遗传转化的影响

4.3.4转化体的筛选及检测

第五章结论

5.1构建了DHAR基因植物表达双元载体pCSB-DHAR

5.2通过瞬时表达检测了载体pCSB-DHAR的转化效率

5.3优化了仙客来遗传转化体系

5.4获得了转DHAR基因仙客来植株

参考文献

图 版

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