苹果IAA代谢几个关键基因在矮化砧木与miRNA在短枝品种中致矮作用研究

摘要

苹果矮化密植栽培是世界苹果发展的趋势，实现苹果矮化栽培最主要途径是利用好矮化砧木及短枝型品种。虽然矮化砧木及短枝型品种在生产中普遍应用，但矮化机理，特别是分子机理尚未完全揭示。本文分析了长富2号/M9（矮化砧木）和长富2号/MM106（半乔化砧木）生长素代谢相关基因的表达情况，研究了几个关键基因在致矮中的功能和作用。利用miRNA组测序手段，分析了普通型富士长富2号和短枝芽变烟富6号中枝条发育相关差异miRNA。从生长素和miRNA角度，揭示矮化砧木和短枝型品种的致矮机理，丰富苹果矮化调控理论。取得的主要研究结果如下:
　　1、对长富2号/M9和长富2号/MM106叶片、接穗韧皮部、砧木韧皮部和根系中的生长素含量、生长素合成基因、生长素运输基因和生长素代谢相关基因进行了分析，结果发现，长富2号/M9中生长素的浓度低于长富2号/MM106。长富2号/M9砧木韧皮部的生长素浓度高于其接穗。在长富2号/M9叶片和根系中，生长素合成基因MdYUCCA8和MdYUCCA10a表达显著低于长富2号/MM106。长富2号/M9砧木韧皮部和根系中，生长素运输基因MdPIN1b和MdPIN8a显著低于长富2号/MM106。长富2号/M9中的生长素轭合酶基因MdGH3-5b和MdGH3-9a显著低于长富2号/MM106。然而，长富2号/M9中的生长素水解酶基因MdIAR3c和MdILL6c显著高于长富2号/MM106。
　　2、在M9和MM106中克隆了MdYUCCA8基因，该基因编码1272bp核苷酸，二者序列相似性99.9％，编码423个氨基酸。克隆了MdYUCCA8编码区上游1600bp启动子序列，二者相似性为99.6％。MdYUCCA8启动子受到GA、MJ和Br诱导，亚精胺和乙烯利显著抑制了MdYUCCA8启动子活性。高温促进MdYUCCA8的表达，烟草叶片双荧光素酶瞬时表达实验证明MdPIF4a与MdYUCCA8启动子互作。在拟南芥中异位表达MdYUCCA8，促进了拟南芥植株花茎的生长、顶端优势显著增加、侧枝减少、角果畸形、促进了根系的生长，侧根数量和侧根长度显著高于野生型。
　　3、在M9和MM106中克隆了MdYUCCA10a基因，该基因编码1149bp核苷酸，二者序列相似性99.9％，编码382个氨基酸。克隆了MdYUCCA10a编码区上游1800bp启动子序列，二者相似性为99.7％。MdYUCCA10a启动子受到ABA、Spe诱导，乙烯利显著抑制MdYUCCA10a启动子活性。在拟南芥中异位表达MdYUCCA10a，促进了拟南芥植株花茎的生长，促进了根系的生长，主根长度、侧根数量和侧根长度显著高于野生型。
　　4、在M9和MM106中克隆了MdABCB19基因，其编码1250个氨基酸，含有两个ABC_membrance结构域，两个ABC_tran结构域。该序列在M9和MM106中存在一个非同义SNP，编码氨基酸由A突变为S，导致M9α螺旋少了一段。MdABCB19在砧木M9和MM106、长富2号/M9和长富2号/MM106均差异表达。启动子序列分析发现M9的MdABCB19启动子在起始密码子上游170bp处有“CTCTGT”6个碱基缺失，导致M9缺失了一个5'UTR Py-rich stretch motif。MM106MdABCB19的启动子活性高于M9MdABCB19，并且MdABCB19启动子受光照调控。MdABCB19启动子活性随着5'UTR Py-rich stretch motif元件数目的增加而增强。
　　5、在长富2号及短枝型芽变烟富6号顶梢中，共发现700个成熟的miRNA，包括202个苹果已知miRNA和498新miRNA。长富2号和烟富6号中有135个差异表达的miRNA，大多数差异的已知miRNA在烟富6号中下调表达。烟富6号枝条顶梢IAA、GA、ZR和ABA含量都低于长富2号。喷施GA可以促进烟富6号短枝生长，变为长枝。烟富6号顶梢中细胞伸长和细胞分裂相关基因的表达水平都显著低于长富2号。
　　综上所述，生长素在砧木诱导接穗矮化中起着重要作用，长富2号/M9中低表达的生长素合成基因MdYUCCA8和MdYUCCA10a可能导致长富2号/M9中低的生长素含量。M9MdABCB19启动子5'UTR Py-rich stretch motif缺失，可能造成M9中MdABCB19表达量降低，生长素运输减弱，植株矮小。GA和miRNA在烟富6号短枝发育中起着关键调控作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 苹果矮化砧木种质资源与致矮机理研究进展

1．1．1 矮化砧木种质资源

1．1．2 苹果砧木致矮机理研究进展

1．2 植物体内生长素代谢

1．3 苹果短枝型研究进展

1．4 本论文的研究目的意义

第二章 生长素合成、运输和代谢基因在苹果砧木中表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 采样

2．1．3 树体生长指标测定

2．1．4 生长素测定

2．1．5 RNA提取及反转录

2．1．6 苹果基因组中生长素相关基因确定

2．1．7 基因表达量测定

2．1．8 GH3酶活性测定

2．1．9 基因表达聚类分析

2．1．10 数据处理与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 株高和根系生长量

2．2．2 生长素含量

2．2．3 苹果生长素合成基因MdYUCCA基因鉴定及表达分析

2．2．4 苹果生长素运输基因MdPIN基因鉴定及表达分析

2．2．5 苹果生长素轭合酶基因MdGH3鉴定及表达分析

2．2．6 苹果生长素轭合物水解酶基因MdILR基因家族鉴定及表达分析

2．2．7 生长素含量和生长素代谢基因表达量聚类分析

2．3 讨论

第三章 MdYUCCA8和MdYUCCA10a克隆及功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 基因克隆

3．1．2 蛋白质保守结构域分析和进化分析

3．1．3 启动子GUS染色及测定

3．1．4 农杆菌感受态细胞的制备

3．1．5 农杆菌的转化

3．1．6 烟草双荧光素酶瞬时表达

3．1．7 拟南芥种植

3．1．8 拟南芥转基因

3．2 结果与分析

3．2．2 MdYUCCA8和MdYUCCA10a基因启动子克隆及顺式作用元件分析

3．2．3 MdYUCCA8和MdYUCCA10a基因启动子对外源激素响应

3．2．4 温度对M9苹果苗生长的影响

3．2．5 双荧光素酶瞬时表达验证MdYUCCA8启动子和MdPIF4a在烟草叶片中的相互作用

3．2．6 拟南芥中异位表达MdYUCCA8和MdYUCCA10a表型观察

3．3 讨论

第四章 苹果生长素运输基因MdABCB19克隆及其在矮化砧木中的表达

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．4 MdABCB19的表达分析与生长素含量测定

4．1．6 MdABCB19启动子活性分析

4．2 结果与分析

4．2．2 长富2号／M9和长富2号／MM106中MdABCB19的表达

4．2．4 MdABCB19启动子的克隆与分析

4．2．5 M9和MM106 ABCB19启动子活性分析

4．3 讨论

第五章 长富2号及短枝芽变烟富6号miRNA组分析

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料

5．1．2 树体生长测量

5．1．3 激素测定

5．1．4 GA处理

5．1．5 miRNA测序样品制备

5．1．6 miRNA鉴定

5．1．7 miRNA靶基因预测

5．1．8 GO富集和KEGG途径分析

5．1．9 miRNA和mRNA的荧光定量PCR验证

5．2 结果与分析

5．2．1 长富2号和烟富6号的生长特性

5．2．2 植物激素含量

5．2．3 长富2号和烟富6号中miRNA测序数据质量分析

5．2．4 差异表达miRNA的分析

5．2．5 miRNA靶基因预测

5．2．6 长富2号和烟富6号茎尖miRNA靶基因GO和KEGG分析

5．2．7 长富2号和烟富6号中参与SAM发育相关miRNA及其靶基因定量验证

5．2．8 长富2号和烟富6号中参与节间伸长相关miRNA及其靶基因定量验证

5．2．9 烟富6号和长富2号中其它差异miRNA及其靶基因的表达验证

5．2．10 细胞周期和细胞伸长相关基因的表达

5．2．11 激素相关基因表达

5．3 讨论

第六章 结论与创新点

6．1 结论

6．2 主要创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介