黄瓜超矮生基因scp-1功能初步分析及酵母双杂交cDNA文库的构建

摘要

株高是影响黄瓜生产的重要农艺性状，目前对黄瓜株高调控机制的研究报道较少。油菜素甾醇类化合物(BRs)是调控植物株高的主要激素之一，对BR矮生突变体的研究有助于揭示黄瓜株高调控的分子机制。课题组前期以一个超矮生黄瓜突变体C257为材料，已将其矮生突变基因scp-1定位在6.6cM区间，结合MutMap分析，在其定位区间内发现有8个基因的14个SNP发生了非同义突变。本研究在上述工作基础上，克隆了scp-1候选基因，并对scp-1进行功能初步分析。此外，黄瓜的下胚轴是黄瓜植株的第一节间，下胚轴及其以上节间共同决定了黄瓜的株高，下胚轴的长度也与壮苗和田间定植密切相关。本试验以CCMC的叶片和下胚轴为材料，构建了黄瓜酵母双杂交cDNA文库，并筛选黄瓜长下胚轴突变体候选基因CsLH1的互作蛋白。主要结果如下:
　　1、依据突变体C257的表型和暗形态建成，表明C257为BR相关突变体。外源油菜素内酯(BL)喷施处理能够恢复C257的部分表型，说明C257为BR合成缺陷突变体。克隆了C257和CCMC的scp-1候选基因CsCYP85A，序列比对结果表明，在C257的CsCYP85A基因编码区470bp位置，发生了G到A的碱基突变，导致该基因编码的蛋白被截短。利用该位点设计CsCYP85A-dCAPS标记，在C257与GY14的F2小群体中进行遗传连锁分析，结果表明，CsCYP85A-dCAPS标记与scp-1共分离;在412份黄瓜种质中对C257的CsCYP85A突变位点进行位点多样性分析，结果表明此突变位点是唯一的。以上结果表明CsCYP85A是scp-1最可能的候选基因。通过生物信息学分析发现，在黄瓜基因组有3个CsCYP85A基因，依次命名为CsCYP85A1、CsCYP85A2和CsCYP85A3，其中CsCYP85A1在突变体和野生型植株的雄花、雌花、茎、叶、根均表达，而CsCYP85A2和CsCYP85A3的表达量难以检测。CsCYP85A1在野生型植株中的表达受BL反馈调节抑制，而在突变体中则不受影响。
　　2、以华北型密刺黄瓜CCMC植株幼苗期叶片和下胚轴为材料，构建酵母双杂交cDNA文库，经检测库容为9.45×105cfu，文库滴度为9.72×107cfu/ml，文库插入片段主要分布在250～2000bp之间，重组克隆阳性率≥80％。
　　3、构建黄瓜长下胚轴突变体候选基因CsLH1的诱饵载体，通过酵母双杂交点对点验证，初步证明CsLH1与CsHY5互作。利用构建的酵母双杂交cDNA文库，初步筛选到一个与CsLH1互作的蛋白GATA transcription factor24-like。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 油菜素内酯调控的植株矮化

1．1．1 与BR相关的矮生突变

1．1．2 BR的生物合成

1．1．3 CYP85A研究进展

1．2 酵母双杂交研究进展

1．2．1 酵母双杂交的原理

1．2．2 酵母双杂交的应用

1．3 植物下胚轴伸长研究进展

1．4 本研究的目的意义

第二章 黄瓜超矮生候选基因scp-1功能的初步分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 突变体C257的暗形态建成和光形态建成

2．2．2 突变体C257对外源BL的响应

2．2．3 CsCYP85A-dCAPS与scp-1的连锁分析

2．2．4 突变体CsCYP85A的SNP位点多样性分析

2．2．5 CsCYP85A的克隆及序列分析

2．2．6 CYP85A进化树分析

2．2．7 CsCYP85A基因的组织特异性表达分析

2．2．8 外源BL对CsCYP85A1表达的反馈调节

2．3 讨论

第三章 黄瓜酵母双杂交cDNA文库的构建

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 总RNA的提取与检测

3．2．2 ds cDNA的合成和纯化

3．2．3 黄瓜酵母双杂交cDNA文库滴度测定和重组效率检测

3．3 讨论

第四章 CsLH1互作蛋白的筛选

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果分析

4．2．2 pGBKT7-LH1诱饵载体的构建

4．2．3 诱饵载体的自激活及毒性检测

4．2．4 CsLH1与CsCOP1、CsHY5互作分析

4．2．5 CsLH1互作蛋白的初步筛选

4．2．6 GATA transcription factor 24-like基因序列分析及功能预测

4．3 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

缩略词

致谢

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