牛克隆胚胎中组蛋白变体H3.3替换模式研究

摘要

在真核生物中基因组DNA以染色体的形式被包装，而染色体的基本单位是核小体，由147 bp DNA环绕核心组蛋白八聚体而成，有五种类型:H1、H2A、H2B、H3、H4。最近的研究中发现在染色体中存在很多组蛋白变体的形式，它们与经典组蛋白之间在序列上仅存在几个氨基酸的差异。并且阐明了许多在染色体装配和形成中的分子机制，在概念上分为DNA复制依赖性通路和DNA复制非依赖性通路。通常大多数核小体由经典组蛋白组成，它们与DNA的复制过程紧密相关。已有研究表明许多组蛋白变体能定位到染色体的特定区域，在转录调控和表观修饰记忆上起到了重要的作用。在哺乳动物中，组蛋白变体H3.3作为基因活跃表达的标记在染色体环境中的调控和表达过程中调节不同区域DNA片段的活性，如DNA修复，转录调控，或者DNA复制过程。近年来随着蛋白质组学技术的逐渐发展，人们已经发现了许多卵子中存在的一些母源因子，在重编程过程中发挥重要作用。组蛋白变体H3.3就是母源因子之一，该蛋白在核移植以后，可以替换掉供体细胞中的H3，并且影响到一些其它多能性基因的表达，但是有关调控机制的研究还不是很清楚。牛作为繁殖周期长的家畜，有关核移植机理方面的研究报道较少。在牛核移植胚胎中对是否存在组蛋白变体H3.3的动态替换的过程，它的作用过程和发生机制如何，目前还未见报道。为了阐明这个问题，本论文通过已构建Flag和HA标记的H3f3b基因真核表达载体，分别在体细胞和胚胎中进行显色表达，构建核移植中组蛋白变体H3.3交换研究平台，进行了相关研究，研究结果如下:
　　1通过构建的Flag和HA标记的H3f3b基因真核表达载体在293T细胞及牛胎儿成纤维细胞上验证，表明载体的有效性及融合蛋白可以特异性的定位在细胞核上。
　　2载体转染细胞后，经免疫荧光鉴定，成功筛选出能稳定表达Flag标记的组蛋白变体H3.3融合蛋白的成纤维细胞株。
　　3体外转录出带有HA标签的H3.3 mRNA，分别转染体细胞和卵母细胞显微注射，进行了表达鉴定，表明带有HA标签的H3.3 mRNA在体细胞和卵母细胞中均能准确表达和定位。
　　4将正确表达的HA-H3.3 mRNA显微注射到GⅤ期卵母细胞进行体外成熟培养，发现随着卵母细胞发育，HA-H3.3在核中的表达信号明显减弱且主要集中在MⅡ期卵母细胞的纺锤体及排出的第一极体中。HA-H3.3 mRNA显微注射到MⅡ期卵母细胞表达稳定后，观察到HA-H3.3信号主要集中于卵母细胞核中，但是在胞质中也有弥散性分布。将HA-H3.3 mRNA显微注射于1-cell克隆胚胎中，发现HA-H3.3信号集中于1-cell克隆胚胎核中，推测在牛胚胎中存在H3.3替换的发生。
　　5选择未处理的牛胎儿成纤维细胞作为供核细胞注射到表达HA-H3.3 mRNA的去核卵母细胞中，观察到激活后核移植胚胎中卵母细胞中的HA-H3.3信号逐渐募集到供体核中，并在原核期信号表达最强。选择稳定表达Flag标记的组蛋白变体H3.3融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞作为供核细胞，注射进正常成熟并去核的MⅡ卵母细胞，观察到激活后克隆胚胎中Flag标记的组蛋白变体H3.3快速丢失，在2-cell期克隆胚胎中完全观察不到Flag标记的组蛋白变体H3.3的信号。从以上两方面证实牛卵母细胞在核移植过程中存在组蛋白变体H3.3的动态替换过程。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 组蛋白变体H3.3的研究进展

1．1 组蛋白不同变体的序列和表达模式

1．2 组蛋白变体H3.3的主要功能与作用机制

1．2．1 H3.3的功能：促进和抑制基因转录的平衡器

1．2．2 在多细胞生物中H3.3特异性富集的机制

1．2．3 在酵母中H3的替换机制

1．3 组蛋白在繁殖，发育，以及重编程过程中的作用

1．3．1 在多细胞生物中H3.3的组蛋白替换对于繁殖是必要的

1．3．2 组蛋白H3.3在精子形成中的作用

1．3．3 H3.3是卵母细胞重编程过程中的一个必需的母源因子

第二章 核移植对体细胞重编程影响的研究进展

2．1 供核体细胞在卵母细胞中的重编程过程

2．2 核移植胚胎在发育过程中的重编程异常

2．2．1 基因异常表达造成的克隆胚胎发育障碍

2．2．2 DNA甲基化及组蛋白修饰造成的克隆胚胎发育障碍

2．2．3 在克隆胚胎中体细胞染色体遗留的表观遗传记忆

2．2．4 克隆胚胎的其他异常

第三章 带有HA和Flag标签的h3f3b基因真核表达载体的表达鉴定及供核细胞筛选

3．1 实验材料

3．1．1 载体、菌株和细胞

3．1．2 主要试剂及耗材

3．1．3 常用试剂配置

3．1．4 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 带有HA和Flag标签的h3f3b基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-Flag／HA-h3f3b的质粒鉴定及扩增

3．2．2 脂质体转染重组载体到293T细胞及牛胎儿成纤维细胞

3．2．3 免疫荧光染色分析鉴定重组载体在细胞中的表达情况

3．2．4 牛胎儿成纤维细胞的电转染

3．2．5 筛选能稳定表达带有Flag标签H3.3融合蛋白的牛成纤维细胞株

3．3 结果

3．3．1 带有Flag和HA标签的h3f3b基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-Flag／HA-h3f3b的质粒扩增结果

3．3．3 免疫荧光染色分析鉴定重组载体在293T及牛成纤维细胞中的表达

3．3．4 筛选出能稳定表达带有Flag标签H3.3融合蛋白的牛成纤维细胞株并通过免疫荧光鉴定出阳性克隆

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 对于牛早期胚胎中H3.3的定位及SCNT胚胎中替换模式的观察

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂及耗材

4．1．2 常用试剂配置

4．1．3 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 体外转录mRNA及mRNA的纯化

4．2．2 脂质体转染体外转录的mRNA到293T细胞及免疫荧光染色鉴定

4．2．3 卵母细胞的采集和成熟培养

4．2．4 卵母细胞的孤雌激活

4．2．5 卵母细胞的mRNA显微注射

4．2．6 注射mRNA后的卵母细胞裂解及qRT-PCR分析

4．2．7 体细胞核移植的操作步骤

4．2．8 牛卵母细胞和胚胎的免疫荧光染色及荧光密度分析

4．2．9 通过核移植及显微注射操作的配合研究组蛋白变体H3.3在SCNT胚胎中的动态替换过程

4．3 结果

4．3．1 体外转录mRNA的结果及在细胞及卵母细胞验证作用

4．3．2 对于牛卵母细胞及早期胚胎阶段组蛋白变体H3.3的定位观察

4．3．3 组蛋白变体H3.3在牛SCNT胚胎中的动态替换过程

4．4 讨论

4．5 小结

全文结论

创新点及后续研究工作

参考文献

致谢

作者简介