骆驼刺内生细菌新种Pantoea alhagi LTYR-11Z的鉴定及其促作物抗旱机制初步研究

摘要

干旱是影响植物生长发育和产量至关重要的非生物胁迫因素之一。植物内生菌和植物的共生以及相互作用不仅能够促进植物的生长发育，还能提高植物对干旱胁迫的抵抗能力。本研究从西北荒漠地区采集的骆驼刺植物组织中分离获得一株内生细菌LTYR-11Z，通过16S rRNA基因和atpD，gyrB，infB，rpoB等保守持家基因的序列比对和系统进化分析发现LTYR-11Z属于Pantoea属。生理生化特征、脂肪酸组分和DNA-DNA杂交等多相分类研究结果表明菌株LTYR-11Z是Pantoea属的1个新种，将其命名为Pantoea alhagi sp.nov。进一步研究发现，该菌株具有非常强的抗逆性，能够耐受9％氯化钠(NaCl)、48℃高温、20％聚乙二醇(PEG)，在pH5.0-9.0的范围内生长，同时含有多种促进植物生长的（plant growth-promoting，PGP）特性，如能够溶解无机磷、产生吲哚乙酸(IAA)、铁载体、胞外多糖(EPS)、蛋白酶和氨。
　　本实验通过共聚焦显微观察，检测了绿色荧光蛋白标记的Pantoea alhagi LTYR-11Z对小麦和拟南芥的定殖能力，结果显示该菌株能够快速吸附在小麦和拟南芥根部，随着时间的延长，定殖细菌数量逐渐增加。盆栽实验结果表明在非干旱条件下，施用了Pantoea alhagi LTYR-11Z的小麦幼苗的生物量显著增加;在同等干旱胁迫条件下接种了LTYR-11Z的小麦幼苗的生长发育和健康状态明显优于未接菌的对照。此外，接种LTYR-11Z的小麦幼苗与未接种的对照相比，叶部可溶性糖和叶绿素增加、丙二醛(MDA和脯氨酸含量减少。以上结果表明Pantoea alhagi LTYR-11Z不仅能够促进小麦生长，还能够提高小麦对干旱胁迫的抵抗能力。
　　本研究通过Tn5转座子对该菌株进行基因组插入突变，构建了含3000多个突变体的转座子突变体库。对200个突变体进行小麦根部吸附实验，筛选获得3株对小麦根部吸附能力显著下降的突变株。运用转座子挽救法对侧翼序列进行克隆并且测序，发现这3株突变体中Tn5分别插到脂多糖合成基因waaG和转录调控基因cra内部以及糖原合成相关基因galU的启动子区域，其中waaG基因突变后该菌株对小麦的吸附能力下降最为显著，表明该基因可能在吸附和定殖方面发挥重要的作用。
　　为研究waaG基因的功能，本研究通过基因无痕敲除方法对waaG基因进行缺失突变，并进一步研究其表型和功能的变化。通过GFP标记的野生型LTYR-11Z和RFP标记的突变株△waaG共同侵染小麦根部，共聚焦显微镜观察发现△waaG在小麦根部的吸附量明显小于野生型。在吸附后第1、4、7、10天分别检测定殖到小麦根部组织内部的细菌数量，结果显示△waaG定殖到小麦根部的菌量仅是野生型的1/6。盆栽实验表明，在干旱胁迫18天后，施用了△waaG的小麦幼苗的生物量和健康程度明显较接种野生型的小麦幼苗差，存活率仅是野生型的1/13，表明waaG基因缺失严重削弱内生菌LTYR-11Z的定殖和促小麦耐旱能力。
　　综上所述，分离自西北荒漠耐旱植物骆驼刺的内生细菌新种Pantoea alhagiLTYR-11Z不仅能够促进小麦生长，还能在干旱条件下增加小麦的生物量，提高小麦抗旱能力。而waaG基因缺失后，突变体对小麦的定殖能力以及促小麦抗旱能力显著降低;表明该基因与Pantoea alhagi LTYR-11Z的定殖及促作物抗旱功能密切相关，其作用机理有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物内生菌概述

1．1．1 植物内生菌定义

1．1．2 植物内生细菌的多样性

1．1．3 植物内生细菌及其生物学作用

1．2 植物内生细菌与植物相互作用提高作物的抗逆性

1．2．1 植物内生细菌在植物内定殖研究

1．2．2 植物内生细菌促作物抗干旱研究

1．3 转座子及转座子诱变

1．3．1 转座子简介及其应用

1．3．2 Tn5转座子特点和应用

1．4 脂多糖

1．5 选题的依据、目的和意义

1．5．1 研究的依据

1．5．2 目的和意义

1．5．3 技术路线

第二章 骆驼刺内生细菌Pantoea alhagi LTYR-11Z的分离鉴定

2．1 前言

2．2 实验材料和试剂

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂和培养基

2．3 实验方法

2．3．1 内生细菌LTYR-11Z的分离

2．3．2 内生细菌LTYR-11Z 16S rRNA测定

2．3．3 内生细菌LTYR-11Z保守基因扩增

2．3．5 全细胞脂肪酸

2．3．6 表型特征

2．3．7 PGP特征及非生物胁迫抵抗能力

2．3．8 植物根部吸附

2．3．9 盆栽实验

2．4 结果分析

2．4．1 测序系统进化分析

2．4．2 基因组G+C含量和DNA-DNA杂交分析

2．4．3 全细胞脂肪酸分析

2．4．4 表型特征分析

2．4．5 PGP结果与非生物胁迫抵抗能力分析

2．4．6 植物根部吸附能力分析

2．4．7 菌株LTYR-11Z促进作物生长和提高作物抗逆性分析

2．5 讨论

第三章 LTYR-11Z小麦根部吸附能力下降突变体的获得及突变基因的鉴定

3．1 前言

3．2 实验试剂和培养基

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验培养基

3．3 实验方法

3．3．1 双亲株滤膜结合法

3．3．2 小麦根部吸附能力下降突变株的筛选

3．3．3 吸附能力下降突变体正确性的验证

3．3．4 小麦根部吸附能力下降相关基因鉴定

3．4 结果分析

3．4．2 小麦根部吸附能力下降突变体正确性的验证分析

3．4．3 菌落PCR验证转化出单克隆的正确性分析

3．4．4 Tn5插入位点blast比对定位分析以及物理图谱绘制

3．5 讨论

第四章 突变基因的敲除及其功能研究

4．1 前言

4．2 实验试剂和培养基

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验培养基

4．3 实验方法

4．3．1 感受态制备

4．3．2 waaG基因突变体构建

4．3．3 敲除质粒PK18-△waaG的构建

4．3．4 waaG基因缺失突变体筛选

4．3．5 互补质粒pBBR1-MCS-waaG的构建

4．3．6 表型实验

4．3．7 绿色荧光标记和红色荧光标记菌株的制备以及小麦根部吸附共聚焦显微镜观察

4．3．8 小麦根部短期定殖的方法

4．3．9 盆栽干旱胁迫实验

4．4 结果分析

4．4．1 表型实验分析

4．4．2 植物根部吸附分析

4．4．3 植物根部短期吸附和定殖结果分析

4．4．4 盆栽实验结果分析

4．5 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

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