陕西省部分地区猪病毒性腹泻流行病学调查及病原学分析

摘要

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是猪病毒性腹泻的主要病原，不同年龄段的猪（尤其是仔猪）均易感，猪感染后以腹泻、脱水、呕吐为主要临床特征，PEDV和TGEV已成为降低仔猪成活率的重要原因之一，对世界各国的养猪业造成了非常严重的经济损失。为了解陕西省PEDV和TGEV的流行病学及病原学特征，明确陕西省的流行毒株与疫苗株、经典毒株和国内外流行毒株的亲缘关系及变异情况，进而为陕西省综合防控PEDV和TGEV及研发更加合理有效的疫苗提供理论依据及参考数据，本研究拟对陕西省部分地区进行PEDV和TGEV的流行病学调查，并对这两种病毒的遗传变异情况进行分析。研究取得如下结果。
　　1.利用PCR法检测了714份腹泻病料中的PEDV。结果显示，检测出PEDV阳性病料288份，PEDV的阳性率为40.33％。在西安、咸阳、渭南、宝鸡地区病料中均检测到了PEDV，其中西安地区病料中PEDV阳性率最高，为46.94％。不同季节采集的病料中均检测到了PEDV，其中冬季病料中PEDV阳性率最高，为57.96％。采集不同生长时期猪群的病料中也均检测出了PEDV，其中哺乳仔猪的PEDV阳性率最高，为70.42％。
　　2.利用PCR法检测714份腹泻病料中的TGEV。结果显示，检测出TGEV阳性病料69份，TGEV阳性率为9.97％，其中PEDV与TGEV混合感染的阳性病料20份，PEDV与TGEV混合感染阳性率为2.81％。在西安、咸阳、渭南、宝鸡地区病料中均检测到了TGEV，其中咸阳地区病料中TGEV的阳性率最高，为14.34％。不同季节采集的病料中均检测出了TGEV，其中冬季病料中TGEV的阳性率最高，为17.05％。采集哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪、经产母猪的病料中均检测出了TGEV，阳性率分别为15.88％、8.52％、4.45％、7.29％，而后备母猪和种公猪中未检测到TGEV。
　　3.将处理好的PEDV阳性病料接种Vero细胞进行病毒的分离，通过细胞病变观察、PCR、电镜观察等方法鉴定病毒。结果表明，该病毒能使细胞变圆、皱缩，继而出现细胞破碎、脱落、拉丝等病变，经PCR和电镜观察鉴定为PEDV，并命名为PEDV-SX株。以疫苗株CV777的基因组序列为模板，利用Primer5.0设计了15对相互重叠的引物，进行全基因组的扩增及测序。利用DNA star软件中的SeqMan软件对序列进行拼接，并用MegAlign软件对目的基因进行同源性的比较和遗传进化分析。结果表明，PEDV-SX株与疫苗株的同源性为98％，与经典毒株的同源性为97.8％，与国内外流行株的同源性为97.2％～99.9％。PEDV-SX株与2012中国山东分离的SD-M株和2008年中国江苏分离的JS2008株处在系统发育树的同一个分支上。
　　4.通过对TGEV-SX株的S、M、N、E基因进行分子克隆和测序，成功获得了S、M、N、E基因序列。利用DNA star软件中的MegAlign软件对目的基因进行同源性比较和遗传进化分析。结果表明，TGEV-SX株的S、M、N、E基因与8株参考毒株的同源性分别为98.0％～99.5％、98.1％～100％、97.9％～99.8％、96.8％～99.2％。TGEV-SX株的S基因与SC-Y株、SHXB株、virulent Purdue株、Purdue P115株同属一个大的分支，而TGEV-SX株的M、N、E基因与Miller M6株、Miller M60株、H16株、TS株同属一个大的分支。
　　本研究发现在陕西省部分地区猪群中均有PEDV与TGEV感染，PEDV的感染率较高，且主要感染哺乳仔猪，并存在二者混合感染。同源性分析及遗传进化分析发现，PEDV-SX株与2012中国山东分离的SD-M株和2008年中国江苏分离的JS2008株的亲缘关系较近，而与疫苗株CV777亲缘关系较远。同时也发现TGEV-SX株S基因与SC-Y株、SHXB株、virulent Purdue株、Purdue P115株亲缘关系较近，而TGEV-SX株的M、N、E基因与H16、TS株、Miller株亲缘关系较近。

目录

论文说明

声明

摘要

前言

第一章 PEDV与TGEV的病原学及流行病学特征

1．1 PEDV的流行病学特征

1．2 PEDV的病原学特征

1．3 TGEV的流行病学特征

1．4 TGEV的病原学特征

1．5 本研究目的与意义

第二章 PEDV的流行病学调查

2．1 材料与方法

2．1．1 样品来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 病料处理

2．2．2 RNA提取及反转录

2．2．3 PEDV PCR检测

2．3 结果

2．3．1 PCR检测结果

2．3．2 不同地区的PEDV的阳性率

2．3．3 不同季节PEDV的阳性率

2．3．4 不同生长时期猪群PEDV的阳性率

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 TGEV的流行病学调查

3．1 材料与方法

3．1．1 样品来源

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 病料处理

3．2．2 RNA提取及反转录

3．2．3 TGEV PCR检测

3．3 结果

3．3．1 PCR检测结果

3．3．2 不同地区的TGEV的阳性率

3．3．3 不同季节TGEV的阳性率

3．3．4 不同生长时期猪群TGEV的阳性率

3．3．5 PEDV与TGEV混合感染情况

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PEDV全基因组序列的测定及进化分析

4．1 材料

4．1．1 病料、细胞

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 PEDV的分离

4．2．2 PEDV分离株的鉴定

4．2．3 PEDV全基因组的PCR扩增及测序

4．2．4 PEDV全基因组的同源性及遗传进化分析

4．3 结果

4．3．1 PEDV分离结果

4．3．2 PEDV分离株的鉴定

4．3．3 PEDV-SX株全基因组片段的PCR扩增结果

4．3．4 PEDV-SX株全基因组的同源性及遗传进化分析结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 TGEV结构基因的测定及进化分析

5．1 材料

5．1．1 材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 TGEV结构基因的克隆

5．2．2 TGEV结构基因的同源性及遗传进化分析

5．3 结果

5．3．1 TGEV结构基因的克隆结果

5．3．2 TGEV结构基因的同源性及遗传进化分析结果

5．4 讨论

4．5 小结

结论与创新点

参考文献

缩略词

致谢

作者简介