Col XV对脂肪细胞分化和脂代谢的影响及其机制研究

摘要

Collagen XV(Col XV)是胶原家族的成员之一，分布在细胞基底膜表面，在动物生理和病理过程中发挥重要作用。Col XV与Col XVⅢ组成MULTIPLEXINs/内皮抑素产生的胶原蛋白亚类，它们结构上高度保守，在血管生成、炎症发生、肿瘤形成和脂肪代谢等方面具有类似功能。研究发现Col XVⅢ促进脂肪细胞分化，增加内脏脂肪的堆积，增加组织重构，维持能量稳态。Col XV在成脂分化过程中表达上调，参与组织再生、能量稳态和肥胖相关疾病的调节，然而Col XV对脂肪细胞分化的调节及其分子机制还有待研究。本研究为了明确Col XV调控脂肪细胞分化的作用机制，在脂肪细胞中超表达和干扰Col XV，得到以下结果:
　　1.Col XV促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解。Col XV在腹股沟白色脂肪、附睾白色脂肪的表达丰度较高，而在肩胛棕色脂肪、肝脏、肌肉和心脏等组织中的表达丰度较低，其中白色脂肪组织中Col XV的表达极显著高于棕色脂肪中的表达(P＜0.01)。在高脂饮食(HFD)诱导下，Col XV在腹股沟白脂、附睾白脂和棕脂中的表达均极显著提高(P＜0.01)。在脂肪细胞中，随着C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达上调，Col XV的表达极显著上升(P＜0.01)，而CREB的表达显著下降(P＜0.05)。油红O和Bodipy染色发现，Col XV促进脂肪细胞分化，加速脂肪细胞内脂滴的积累。超表达Col XV在0d、4d和8d显著促进脂肪细胞分化标志基因C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表达，干扰Col XV后作用相反(P＜0.05)。超表达Col XV促进脂合成基因ACCα和FASN的表达，抑制脂分解基因HSL、LPL和ATGL的表达(P＜0.05)，干扰Col XV后上述基因表达相反。超表达Col XV降低细胞中cAMP和p-PKAThr197的水平，Forskolin逆转这种抑制作用，H89则加强这种抑制作用，干扰Col XV后则激活了cAMP/PKA信号通路。表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路促进脂肪细胞分化和抑制脂解。
　　2.Col XV通过CREB负转录调控脂肪细胞分化和脂代谢。通过构建长度递减的ColXV启动子荧光素酶报告载体和CREB结合位点（CRE）定点突变的荧光素酶报告载体，双荧光素酶活性分析发现CREB结合在Col XV启动子上-354bp～-334bp处，抑制ColXV的转录活性。油红O染色发现超表达Col XV促进脂肪细胞脂质积累，干扰Col XV降低了脂质生成，CREB激动剂Forskolin处理后使脂滴消融。超表达Col XV促进C/EBPβ、PPARγ和FABP4等的基因表达，干扰Col XV抑制脂分化基因的表达，而Forskolin处理进一步降低了它们的表达。超表达Col XV促进FASN和ACCα的表达，抑制HSL的表达，Forskolin逆转了超表达Col XV对脂代谢的作用。干扰Col XV降低FASN和ACCα的表达，提高HSL的表达，Forskolin增强了干扰Col XV后的作用。表明Col XV通过CREB负转录调节它的启动子活性，进而影响脂肪细胞分化和脂代谢。
　　3.Col XV通过DNA甲基化调节脂肪细胞分化和脂代谢。采用亚硫酸氢盐测序法发现在脂肪细胞分化后Col XV的DNA甲基化水平降低，Col XV的表达水平升高，甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)和CpG结合蛋白3(Mbd3)的mRNA表达显著降低。在脂肪细胞分化第0d和4d，Col XV超表达后抑制了Dnmt1的表达，甲基转移酶抑制剂5-azacytidine(5-Aza-dC)加剧了这一作用，对Dnmt3a和Dnmt3b的作用不显著。5-Aza-dC抑制Col XV的DNA甲基化水平，促进它的mRNA表达。在脂肪细胞分化第0d，Col XV超表达促进C/EBPβ、PPARγ的表达，5-Aza-dC显著降低C/EBPβ、PPARγ的表达;而第4d在Col XV甲基化被抑制后Col XV上调的C/EBPβ和PPARγ的表达被进一步增强。在脂肪细胞分化第0d和第4d，超表达Col XV抑制HSL的mRNA表达，在Col XV甲基化水平降低后加剧了这种抑制作用。油红O结果一致，在分化的脂肪细胞中超表达Col XV促进脂沉积，干扰Col XV抑制脂沉积，Col XV甲基化被抑制后加速了脂肪细胞内脂滴形成。表明Col XV通过DNA甲基化下调来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞的分解代谢。
　　综上所述，本试验表明Col XV通过抑制cAMP/PKA信号通路来促进脂肪细胞分化和抑制脂质分解，并证实Col XV通过CREB的负转录调控和DNA甲基化抑制来促进脂肪细胞分化和抑制脂肪细胞分解代谢。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 Collagen XV研究进展

1．1 Collagens家族结构和分类

1．1．1 纤维状胶原

1．1．2 网络形成的胶原

1．1．3 含间断三维螺旋的纤维相关胶原(FACITs)

1．1．4 含间断三维螺旋的膜相关胶原(MACITs)

1．1．5 锚定胶原纤维

1．1．6 片段形成胶原

1．1．7 多螺旋域胶原(MULTIPLEXIN)

1．2 Collagens在脂代谢中的作用

1．2．1 胶原对脂肪细胞分化的调控

1．2．2 胶原对脂肪合成和分解代谢的调节

1．2．3 胶原沉积对肥胖等代谢疾病的影响

1．3 Col XV的结构与功能

1．3．1 Col XV的结构、分布和表达模式

1．3．2 Col XV的生理功能

第二章 脂肪细胞分化研究进展

2．1 体内脂肪组织的发育

2．2 脂肪细胞的成脂分化

2．2．1 脂肪细胞分化的转录调节

2．2．2 ECM对脂肪细胞分化的影响

第三章 Col XV促进脂肪细胞分化和抑制脂解

3．1 材料

3．1．1 细胞

3．1．2 主要试剂及设备仪器

3．2 方法

3．2．1 脂肪细胞复苏、培养及冻存

3．2．2 细胞诱导分化

3．2．3 油红O染色

3．2．4 Bodipy染色

3．2．5 质粒提取

3．2．6 质粒载体转染

3．2．7 细胞总RNA提取

3．2．8 反转录及实时荧光定量PCR

3．2．9 细胞总蛋白提取

3．2．10 Western bloting检测

3．2．1 1 数据统计及分析

3．3 结果与分析

3．3．1 Col XV在脂肪细胞和脂肪组织中的表达规律

3．3．2 Col XV促进脂肪细胞分化

3．3．3 Col XV对脂肪细胞代谢的影响

3．3．4 Col XV通过cAMP／PKA调节脂肪细胞分化和脂代谢

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 Col XV通过CREB负转录调控脂肪细胞分化和脂代谢

4．1 材料

4．1．1 实验动物、菌株、质粒及细胞

4．1．2 主要试剂设备仪器

4．2 方法

4．2．1 试剂盒法提取DNA

4．2．2 PCR扩增

4．2．3 胶回收

4．2．4 双酶切产物的连接

4．2．5 质粒转化

4．2．6 荧光素酶报告质粒定点突变

4．2．7 细胞复苏、培养及冻存

4．2．8 质粒载体提取与转染

4．2．9 细胞总RNA提取

4．3．1 Col XV启动子上荧光素酶报告载体的构建

4．3．2 Col XV启动子上转录因子CREB的结合与鉴定

4．3．3 Col XV通过CREB负转录调控脂肪细胞分化和脂代谢

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 Col XV通过DNA甲基化调节脂肪细胞分化和脂代谢

5．1 材料

5．1．1 实验动物、菌株、质粒及细胞

5．1．2 主要试剂和设备仪器

5．2 方法

5．2．1 试剂盒法提取小鼠基因组DNA

5．2．2 BSP方法检测基因的DNA甲基化水平

5．2．3 Real-time PCR

5．2．4 数据统计及分析

5．3 结果与分析

5．3．1 脂肪细胞分化中Col XV DNA甲基化水平变化

5．3．2 Col XV对DNA甲基化转移酶表达的影响

5．3．3 Col XV通过抑制DNA甲基化调节脂肪细胞分化和脂代谢

5．4 讨论

5．5 小结

1 结论

2 创新点

3 进一步研究内容

参考文献

附录

致谢

作者简介