柿果实木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因表达特性及功能分析

摘要

柿果实采后极易软化，不利于鲜柿的贮藏和运输，影响其商品价值。木葡聚糖是高等植物细胞壁半纤维素的主要成分，半纤维素与纤维素微纤丝构成网状结构，对细胞壁的膨胀松软起限制作用，也是细胞壁的主要机械支撑物来源。木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTH）具有催化木葡聚糖分子水解和糖基转移的双重作用，它在植物生长发育、果实成熟软化及逆境胁迫抗性形成等过程中都发挥重要功能。
　　目前XTH发挥功能的机制尚不明确，柿果实XTH基因的发掘和功能研究也鲜有报道。本文首先对柿果实中分离得到的XTH基因家族成员进行表达分析，筛选出参与果实生长发育和成熟软化的关键基因。其次利用体外诱导蛋白和亚细胞定位，在蛋白层面上分析关键基因发挥功能的作用机制。在此基础上，利用转基因手段系统研究柿DkXTH1和DkXTH8基因的功能，揭示XTH在果实生长发育、成熟衰老及逆境胁迫中的重要作用。主要研究结果如下：
　　1.利用RACE技术从‘富平尖柿’中分离得到4条新的柿XTH基因，命名为DkXTH5-8。与DkXTH1-4类似，新基因均具有其他物种XTH的共同特征。聚类分析表明，柿DkXTH1-8基因被聚在Ⅰ/Ⅱ类中。XTH三维结构中Loop2的长度可以调节木葡聚糖内糖基转移酶和水解酶的比例。预测的DkXTH1和DkXTH2三维结构中，二者Loop2结构均包含5个氨基酸，与只具有转移酶活性的PttXET16A相同，但短于只具有水解酶活性的TmNXGl。
　　2.利用qPCR分析8条柿XTH基因（DkXTH1-8）在‘富平尖柿’不同组织和果实生长发育过程中的表达特征。结果发现，DkXTH5和DkXTH1分别在果实第一和第二次快速膨大期出现表达高峰，DkXTH4则在两次快速膨大期均出现表达高峰，三者可能参与果实生长发育。此外，DkXTH1主要在幼嫩组织如幼叶和幼果中起作用，且与XET活性呈明显正相关，推测其与果实的快速膨大有关。DkXTH2、DkXTH3、DkXTH6和DkXTH8在成熟期果实中的表达均高于未成熟果实，可能参与果实后熟进程。尤其是DkXTH8基因的表达伴随着果实硬度的快速下降，其在果实中的表达量远高于其他如花、叶、茎和萼片等组织中的表达。
　　3.以初熟期柿果实为材料，分析不同生长调节剂和冷藏处理对DkXTH1和 DkXTH8表达的影响。结果表明，DkXTH1在果实贮藏过程中表达量很低，但GA3和冷藏处理可以明显诱导该基因表达，可能与保持细胞结构完整、减缓果实硬度下降有关。不同的是， DkXTH8在果实贮藏过程中表达量明显上升，与果实硬度下降呈正相关。丙烯和ABA处理可以明显上调DkXTH8表达，GA3和冷藏处理则相反，推测DkXTH8与果实软化关系密切。
　　4.利用原核表达体外诱导获得可溶性DkXTH1和DkXTH8蛋白，经镍柱纯化后发现二者均具有典型的木葡聚糖糖基转移酶活性，而无水解酶活性。体外获得的DkXTH1和DkXTH8蛋白最适pH分别为5.5和6.0，且pH从5降至4时酶活性显著下降。与DkXTH1相比，DkXTH8蛋白具有更高的XGOs亲和性。洋葱表皮亚细胞定位结果显示，二者均依靠信号肽结构定位于细胞壁中。
　　5.过表达DkXTH1可以提高拟南芥逆境胁迫抗性，延缓转基因番茄果实后熟软化进程。在干旱、盐和ABA胁迫条件下，过表达DkXTH1的拟南芥种子发芽率显著高于野生型。受胁迫后转基因拟南芥幼苗和成熟植株叶绿素含量均显著高于野生型，同时丙二醛含量较低。与野生型相比，过表达DkXTH1的番茄果实在采后贮藏过程中转色慢、果实硬度高，同时乙烯释放及相关基因表达均低于野生型。显微结构观察发现，转基因番茄细胞胞壁及胞间部位密度增大，可能有利于保持细胞壁结构的完整性。
　　6.过表达DkXTH1可以促进拟南芥叶片和茎的生长，促进转基因番茄果实膨大。转基因拟南芥叶片显著较野生型宽大，显微结构观察发现其茎组织中包含更多大体积细胞。绿熟期转基因番茄果实直径也显著大于野生型，过表达DkXTH1促进了番茄细胞膨大，可能由于DkXTH1过度参与细胞壁的整合作用导致的。
　　7.过表达DkXTH8促进拟南芥离体叶片衰老，加速转基因番茄果实后熟软化进程。在黑暗条件下，转基因拟南芥离体叶片叶绿素含量快速下降，伴随着丙二醛含量的上升以及膜透性的增加。此外，与衰老相关的AtSAG12和AtSAG13基因表达量也显著高于野生型。过表达DkXTH8的番茄果实在采后转色迅速、硬度下降快，果实细胞完整性也更快被破坏。与野生型相比，转基因拟南芥和番茄细胞均呈现明显的弯曲形状，且细胞大小不均一，导致细胞间隙增加、相邻细胞的联系不紧密。这种改变可能是DkXTH8过度参与细胞壁重组导致的，它在一定程度上使细胞更易受到氧化胁迫损伤，进而加速植株衰老和果实软化。

目录

声明

第一章文献综述

1.1 果实的成熟与软化

1.2 木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XTH）研究进展

1.3本研究的目的意义

第二章柿XTH基因家族克隆及序列分析

2.1 试验材料与处理

2.2 试剂与仪器

2.3 试验方法

2.4 结果分析

2.5 讨论与小结

第三章柿XTH基因表达模式分析

3.1 试验材料与处理

3.2 试剂与仪器

3.3 试验方法

3.4 结果分析

3.5 讨论与小结

第四章柿XTH原核表达和亚细胞定位研究

4.1 试验材料

4.2试剂与仪器

4.3 试验方法

4.4 结果分析

4.5 讨论与小结

第五章柿DkXTH1基因的功能分析

5.1 试验材料

5.2 试剂与仪器

5.3 试验方法

5.4 结果分析

5.5 讨论与小结

第六章柿DkXTH8基因的功能分析

6.1 试验材料

6.2 试剂与仪器

6.3 试验方法

6.4 结果分析

6.5 讨论与小结

第七章结论与创新点

7.1结论

7.2创新点

参考文献

附录

缩略词

致谢

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