乳酸菌调节肉鸡盲肠miRNAs表达影响沙门氏菌感染的机制研究

摘要

近年的研究表明miRNAs在免疫系统发育和宿主免疫应答调节方面发挥着重要的作用。益生菌能够有效的缓解沙门氏菌带来炎症反应。然而，miRNAs是否并且如何参与肉鸡肠道炎症应答反应的调节是未知并且未报道的。因此本研究探究植物乳杆菌LPZ01（Lactobacillus plantarum Z01）对三日龄初生肉鸡盲肠miRNAs和炎症因子的影响情况。在获得了一些差异表达miRNAs后，进一步的探究重要的差异表达miRNAs的下游靶基因，检测它们是如何影响宿主肠道细胞的。
　　1.本试验处理组包括NC（基础日粮），S（基础日粮+鼠伤寒沙门氏菌处理），SP（基础日粮+鼠伤寒沙门菌处理+LPZ01）和P（基础日粮+LPZ01）。应用深度测序的方法对上述处理组的肉鸡盲肠miRNAs进行测序，本研究得到了不同处理组初生肉鸡在鼠伤寒沙门氏菌感染后1，3，5天盲肠中 miRNAs的表达谱。获得14个 miRNAs（gga-miR-122-5p，gga-miR-193a-5p，gga-miR-194，gga-miR-215-5p，gga-miR-217-3p， gga-miR-375，gga-miR-1559-3p，gga-miR-1769-3p，gga-miR-1788-3p，gga-miR-1798-5p， gga-miR-2954，gga-miR-3525和gga-miR-3531-3p），它们的表达量显著的受到植物乳杆菌处理和/或沙门氏菌处理的影响。选取其中五个免疫相关的miRNAs（gga-miR-215-5p， gga-miR-3525，gga-miR-193a-5p，gga-miR-122-5p和gga-miR-375）用实时定量的方法进行验证，结果发现用实时定量的方法检测的结果和深度测序的方法得到的结果变化趋势相似。
　　2.进一步对差异表达miRNAs的靶基因进行预测，并将预测的靶基因做GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，发现它们富集于cAMP（ Cyclic Adenosine monophosphate）依赖的蛋白激酶活性调节，压力激活MAPK（mitogen-activated protein kinase）级联反应，免疫系统发育和免疫系统调节等GO Terms，它们还富集于免疫相关的MAPK信号通路和Wnt信号通路等。
　　3.用实时定量的方法检测沙门氏菌处理和植物乳杆菌处理对肉鸡盲肠中炎症因子的表达。和阳性对照组，只用沙门氏菌处理过的S组比较，SP组中肉鸡盲肠中定植的沙门氏菌数目显著减少了，并且 SP组中 IFN-γ（ interferon-γ）和 LITAF（lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor alpha factor）的表达量较低。
　　4.对差异表达miRNAs的变化情况和炎症细胞因子的变化情况进行比较分析，发现这些miRNAs直接或间接的调节炎症细胞因子IFN-γ、LITAF和IL（interleukin）-6，进而共同参与宿主免疫应答反应的调节。在36个小RNA库中，miR-215-5p达量最高，占所有36个文库中已知miRNAs reads的40.54％。此外，在36个文库中共得到119个新的潜在miRNAs，新miRNAs的获得显著地丰富了鸡miRNAs数据库并为理解miRNAs功能在宿主盲肠应答和微生物的互作提供了基础。
　　5.在十四个差异表达的miRNAs中，选择miR-193a-5p，通过TargetScan，miRDB和miRecord软件预测其靶基因，从众多的靶基因中获得八个免疫相关的靶基因（TRAF3， C1QTNF2，IL1RAPL1，MMP16，TRAT1，CREB3L2，IFNA7，TNFAIP1），分别构建八个靶基因的野生型和突变型双荧光素酶载体，在肠上皮细胞Caco-2中检测双荧光素酶活性并验证其靶基因，最终得到TRAF3（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor3）为miR-193a-5p的靶基因之一，且miR-193a-5p抑制上皮细胞中TRAF3基因的mRNA的表达和蛋白水平的表达。
　　通过本研究的探索，发现植物乳杆菌处理和/或沙门氏菌处理能够引起新生肉鸡盲肠中miRNAs和炎症因子的表达，且miRNAs直接或间接的调节炎症细胞因子IFN-γ、LITAF和IL-6的表达，进而共同参与宿主免疫应答反应的调节。差异表达miRNAs之一，miR-193a-5p抑制上皮细胞中TRAF3基因的mRNA的表达和蛋白水平的表达。该研究对于认识肠道微生物与宿主互作、微生物对宿主的非编码RNA调控作用均具有重要的理论意义与应用价值。

目录

第一章 文献综述

1.1 沙门氏菌的简介和危害

1.2 益生菌的研究及应用

1.3 MiRNAs的功能简介及其在肠道中的研究.

1.4 本研究的目的意义和主要研究内容

1.5 研究思路

第二章 乳酸菌对雏鸡沙门氏菌感染的miRNAs研究

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 MiR-193a-5p靶向抑制肠道上皮细胞中TRAF3的表达

3.1 试验材料

3.2 试验方法

3.3 试验结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 结论与创新点

4.1 研究结论

4.2 本研究创新点

4.3 进一步研究的课题

参考文献

附录

缩 略 词

致谢

作者简介