地衣芽胞杆菌CK1缓解饲料中玉米赤霉烯酮对藏猪的毒性及其脱毒机制的研究

摘要

玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）是一种由镰刀菌属产生的，具有雌激素效应的真菌毒素，广泛地存在食品、饲料及其原料中。人和动物摄入过多ZEA会引发雌激素过多症，造成生殖系统功能紊乱。猪是对ZEA最为敏感的动物。在畜牧养殖过程中， ZEA 污染的饲料会影响动物的健康，给养殖业带来了巨大的经济损失。与传统的去除ZEA的方法相比，微生物降解ZEA具有特异性强、效率高，对饲料和环境无污染等优点。因此研究微生物降解ZEA脱毒技术是非常必要的。 本研究以一株从土壤中分离获得的、具有ZEA降解能力的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）CK1为研究对象。研究菌株CK1体外发酵降解饲料中ZEA的能力以及经CK1菌降解后的ZEA污染饲料对仔猪的影响。从该菌株中克隆出ZEA降解酶基因，并使其异源表达，初步探究菌株CK1降解ZEA的分子机制，为饲料中酶制剂的应用提供理论基础。主要的试验内容及结果如下： 试验一 研究菌株CK1降解饲料中ZEA的能力。革兰氏染色显示菌株CK1属于革兰氏阳性菌。16S rRNA测序和系统进化树结果表明CK1菌株为地衣芽胞杆菌。菌株CK1 在血平板上没有形成溶血环，且其基因组中未检测到溶血素和肠毒素基因，因此CK1是安全的，可以用来发酵饲料。将ZEA标准品与基础日粮混匀，用菌株CK1体外发酵降解ZEA污染日粮，通过高效液相色谱技术检测饲料中ZEA的含量。结果表明，菌株CK1能够较好的降解饲料中的ZEA，其降解率为61.06%。 试验二 研究 CK1 菌能否缓解饲料中 ZEA 对藏猪的毒害。试验选取 18 头体重为6.48 ± 0.74kg的刚断奶雌性藏猪仔猪，随机分3组，每组6个重复，试验周期为21天。对照组（C）饲喂基础日粮（不含ZEA），处理组1（T1）饲喂ZEA污染日粮，处理组2（T2）饲喂CK1菌处理后的ZEA污染日粮。结果显示，仔猪的生产性能在3个组中差异不显著。T1组仔猪阴户面积和生殖器官相对重量均显著高于对照组，而T2组则显著低于T1组。T1组仔猪血清中促黄体激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、孕酮（P）和雌二醇（E2）水平均显著低于对照组；T2组仔猪血清中LH、P和E2的含量显著高于T1 组；血清中睾酮（T）的水平在 3 个组中均无显著差异。组织病理学检测显示，T1组卵母细胞形态异常，子宫外模脱落，肝脏组织中出现炎性细胞浸润现象，而T2组中这些症状明显减轻且组织形态接近对照组。T1组中，子宫、卵巢ERα的表达量和阴道ERβ的表达量均显著高于T2组和对照组，而这些指标在T2组和对照组之间并无显著差异。在阴道中，T1组中ABCB1和ABCb4表达水平显著高于T2组和对照组，ABCG2 的表达水平与T2组无显著差异，ABCA1和ABCD3的表达水平在3个组中没有显著差异。在子宫中，T1组中ABCA1和ABCb4表达水平显著高于T2组和对照组，而ABCB1、ABCD3和ABCG2的表达水平在3个组中没有显著差异。在卵巢中，T1组中ABCB1、ABCb4、ABCD3和ABCG2的表达水平显著高于T2组和对照组，而ABCB1的表达水平在3个组中无显著差异。在阴道、子宫和卵巢中，ABC转运载体的表达水平在T2组和对照组中均无显著差异（除阴道ABCG2）。结果表明，CK1菌能够缓解饲料中ZEA对仔猪的危害。 试验三 初步探究CK1菌株降解ZEA的机理。通过对已知ZEA降解酶进行生物信息学分析，成功从菌株CK1基因组上扩增到参与ZEA降解的基因prx31，片段大小为564 bp，编码187个氨基酸。NCBI BLAST分析发现，B. licheniformis CK1中的过氧化物酶PRX31属于典型的两个半胱氨酸硫氧还蛋白过氧化物酶（2-Cys Prx）。三维结构显示 PRX31 是环状络合物。将该基因与表达载体 pET-28a (+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建了 PRX31 表达工程菌株，实现了该重组酶的异源表达。用镍柱亲和层析的方法获得纯度较高的蛋白，其浓度为1.45 mg/mL。该重组过氧化物酶PRX31能成功降解ZEA，其降解率为68.99%。该重组过氧化物酶PRX31降解ZEA的最适温度是40℃，最适时间是12 h，最适pH是8.0。此外，ZEA的降解产物可以显著地降低MCF-7细胞的增殖率。结果表明，在CK1菌中，PRX31至少是负责降解ZEA的部分原因。 综上所述，菌株CK1能有效的降解饲料中的ZEA，保护仔猪免受ZEA的毒害，从根本上消除ZEA在食物链中的传播，保证畜产品安全，并为微生物法降解饲料中毒素提供了试验基础和理论依据。此外，初步探讨了菌株CK1降解ZEA的机制，为生物酶制剂的研制和开发提供了新的思路和方法。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 真菌毒素

1.2 食物和饲料中的ZEA

1.3 体内ZEA的吸收、分布、代谢和排泄

1.4 ZEA的毒性

1.5 ZEA限量标准

1.6 策略和降解方法

1.7 ZEA的提取和检测方法

1.8 ABC转运蛋白和过氧化物酶

1.9 研究目的与意义

1.10 技术路线

第二章 CK1菌降解饲料中ZEA的研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 CK1菌降解的ZEA污染饲料对仔猪的影响

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 CK1菌中prx31基因的克隆、表达及功能研究

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 结论与创新点

5.1 研究结论

5.2 创新点

5.3 下一步研究课题

参考文献

附录

缩略词

致谢

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