黄连中重金属Cr和Cd的积累研究

摘要

黄连（coptidis rhizoma）为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao和云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎，分别习称“味连”“雅连”和“云连”。黄连为我国传统根茎类大宗药材之一，是名贵的常用中药，在两千多年前就已作为中药使用。近年来，随着世界各国对中医药认可度的增加，中药的安全性问题也得到了全世界的普遍关注，包括黄连在内的中药材重金属超标问题屡见报道，对其临床用药的安全性及出口产生了严重影响。目前对于黄连重金属的研究都大多只停留在含量检测方面，对重金属元素分布、形态及在植物体内积累解毒机制的研究尚未报道。 本论文以黄连（味连）为研究对象，采用同步辐射X射线荧光微分析（SR-μXRF）、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、同步辐射X射线近边吸收精细结构谱（XANES）及分子生物学技术，对Cr和Cd在黄连中的分布、形态以及与重金属吸收相关的金属硫蛋白基因的表达等进行了深入系统的研究。本论文的主要研究内容和结果如下： 1.采用SR-μXRF和LA-ICP-MS成像技术研究了Cr在黄连根、根茎和叶柄中的空间组织分布特征。元素二维分布图像结果表明，不同组织中Cr的分布模式不同。在黄连根中，Cr主要积累在中央维管柱中，而在根茎中，Cr主要集中在周皮和一些外皮层中，叶柄中的Cr主要积累在皮层和一些维管束中。μ-XRF数据表明，Cr从根部吸收后进入中央维管柱；因此，推测Cr可能通过根内的共质体途径穿过内皮层，然后再沿着木质部向上运输，到达根茎时主要积累在周皮和一些外皮层，到达叶柄时主要积累在皮层和一些维管束中。在黄连中，Cr元素的分布模式与Ca非常相似，提示Cr的吸收有可能与Ca2+通道有关。由于Cr在结构上与某些必需元素相似，因此它会影响植物对矿质营养元素的吸收。叶柄的LA-ICP-MS图谱显示，黄连叶柄在Cr处理下Cu和Mn含量均显著升高。 2.采用LA-ICP-MS技术研究黄连根茎中Cd在黄连根茎中的组织空间分布特征。黄连根茎的LA-ICP-MS图谱显示，Cd主要积累在周皮、皮层、髓部和根迹维管束中，且周皮和皮层中Cd浓度相对较高，髓部和根迹维管束中Cd浓度相对较低。Cd与Ca在物理结构方面具有许多相似性，电荷和离子半径等，结合文献报道Ca2+通道是Cd进入植物的主要途径，推测在黄连中发现的Cd与Ca之间分布模式的相似性，可能也预示着Ca2+通道是Cd进入黄连的一条途径。Cd处理会影响黄连对营养元素的吸收，比如，根茎的LA-ICP-MS图谱显示，Cd处理会影响根茎中Cu、Mn和P元素的吸收。 3.采用ICP-MS技术进一步研究了黄连根、根茎和叶中Cr和Cd的亚细胞分布特征，结果显示细胞壁是黄连中Cr和Cd的主要贮存场所。当植物受到胁迫时，Cr和Cd会穿过植物细胞壁，其中大部分被隔离在液泡中，起到降低Cr和Cd毒性的作用。即在黄连中，Cr和Cd会优先积累在细胞壁中，其次选择积累在液泡中。 4.采用XANES技术研究黄连中Cr元素在黄连中的赋存形态，结果表明，在Cr(VI)处理下的黄连中，存在Cr(VI)向Cr(III)的还原，这种还原是植物一种重要的解毒机制。组氨酸和磷酸盐可能在黄连Cr的积累和解毒过程中发挥了重要作用。XANES线性叠加拟合（LCF）数据发现，在黄连中检测到Cr(0)形态的存在。 5.采用乙醇、去离子水、NaCl、HAc和HCl提取不同形态的Cd，研究Cd在黄连根、根茎和叶中的化学形态。结果显示，在黄连中，Cd主要以移动性小、毒性较低的形态存在，这是黄连能够适应Cd胁迫的原因。在添加Cd处理后，根茎和叶中Cd的HAc和HCl提取态所占比例都有所增加，表明与磷酸盐和草酸盐结合产生难溶的Cd络合物可能是黄连对Cd的解毒机制。 对黄连根、根茎和叶的Cd化学形态及Cr和Cd的亚细胞分布系统研究发现，重金属Cr和Cd在根中的积累量高于根茎和叶，表明黄连将大部分的重金属Cr和Cd固定在根中，避免向地上部分的转移，降低对植物的毒性，这是黄连对Cr和Cd积累的耐受机制。 6.通过对黄连中Cr和Cd的赋存和化学形态的研究，发现，未经Cr处理的黄连根茎中未检测出有毒的Cr(VI)，且Cd在常用的中药提取溶剂乙醇和水中的含量也远远低于规定的Cd≤0.3mg kg-1的国家标准。因此，认为现有的中药重金属限量标准不够完善和合理。元素的价态和化学形态不同，毒性也不同，用单一的某元素的总含量代表其毒性显然不合理，应当结合重金属元素的价态和化学形态等与重金属毒性相关的其他方面综合考量，制定科学合理的中药重金属限量标准。 7.第一次在黄连中克隆出金属硫蛋白基因（CcMT2），并对其进行了组织特异性表达分析及重金属Cr和Cd处理对它表达量影响的研究。结果显示，CcMT2在黄连根、根茎、叶中都有表达，在不同组织中表达量大小的顺序为：叶＞根＞根茎。Cr和Cd处理都会诱导CcMT2的表达量上调。这意味着CcMT2编码的金属硫蛋白可能参与了黄连对重金属的积累和解毒机制。 通过以上研究，明晰了黄连中Cr和Cd元素的积累解毒机制，为降低黄连中Cr和Cd含量的研究提供了理论参考。同时，以黄连Cr和Cd两种重金属深入系统的研究为突破口，提出了制定科学合理的中药重金属标准的建议，为完善中药重金属限量标准提供了数据依据，也为其他中药重金属研究提供了理论基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 黄连简介

1.2 重金属对植物的毒害作用

1.3国内外中草药重金属限量标准现状

1.4 黄连中重金属研究现状

1.5 植物中Cd和Cr的研究进展

1.6 同步辐射技术在植物元素分析中的研究进展

1.7 激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）技术在植物元素分析中的研究进展

1.8 本研究的目的意义

第二章 Cr在黄连中的组织和亚细胞分布特征

2.1 引言

2.2 材料、试剂及仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论与小结

第三章 Cd在黄连中的组织和亚细胞分布特征

3.1 引言

3.2 材料、试剂及仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论与小结

第四章 黄连中Cr的赋存形态研究

4.1 引言

4.2 材料、试剂及仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论与小结

第五章 黄连中Cd的化学形态研究

5.1 引言

5.2 材料、试剂及仪器

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 讨论与小结

第六章 黄连中金属硫蛋白基因CcMT2的克隆和表达分析

6.1 引言

6.2 材料、试剂及仪器

6.3 实验方法

6.4 结果与分析

6.5 讨论与小结

第七章 总结

创新点

展望

参考文献

缩略词

致谢

作者简介