小麦TaCBL4/TaCIPK5与TaCIPK10介导的抗条锈病机理研究

摘要

植物对病原菌的抗性反应涉及一系列的信号识别、信号传导和基因诱导等过程。钙离子是细胞内重要的信号分子，在植物生物生长发育和对外界环境刺激应答反应的信号传导过程中起重要作用。钙传感蛋白感知钙信号，并将信号传递至下游，在钙信号和下游信号通路中起到桥梁作用。钙调神经磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-like proteins，CBL）是植物特有的钙传感蛋白。CBL需要与下游的蛋白激酶（CBL-interacting protein kinases，CIPK）互作以及激活CIPK的激酶活性从而将信号向下传递。研究表明水杨酸（Salicylic Acid，SA）信号通路在拟南芥抵抗活体营养寄生菌侵染的过程中发挥着关键作用。此外，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）也已被证实参与了植物的生物胁迫。 小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst）是一种严格的活体营养寄生菌，其引起的小麦条锈病是威胁小麦生产的流行性真菌性病害。然而，在小麦抗条锈病的过程中，CBL-CIPK信号通路的功能以及CBL-CIPK信号通路与其他抗病信号通路的关系知之甚少。为此，本研究开展了以下工作： 1.利用现有的小麦基因组和转录组数据，以拟南芥水稻的CBL与CIPK基因为种子序列，共搜索到22条CBL序列和74条CIPK序列。根据其与水稻同源基因的关系，分别将其命名为TaCBL1.1至TaCBL9和TaCIPK2至TaCIPK32。小麦所有CBL序列均具有4个EF手结构。序列分析发现在TaCBL1.1、1.2、4、7和8的N端含有一个脂修饰基序（Lipid Modification motif，MGCXXS/T），TaCBL2、3和6包含一段液泡膜定位序列（Tonoplast Targeting Sequences，MSQCXDGXKHXCXSXXXCF），而TaCBL9含有一段跨膜螺旋序列（Transmembrane Helix）。在TaCIPK蛋白序列的N端和C端中，分别含有一个激酶结构域和调控结构域。其中的调控结构域中包含了两个与蛋白互作相关的基序，分别是NAF基序和蛋白-磷酸酶互作（Protein-phosphatase interaction，PPI）基序。小麦TaCBL蛋白家族根据其N端的基序可分为3个类群，而TaCIPK基因家族可根据内含子的数目分为2个类群。小麦原生体质亚细胞定位表明，TaCBL1.1、TaCBL2、TaCBL6和TaCBL9定位在细胞膜，TaCBL3在小麦细胞液泡膜，而TaCBL4在整个细胞中均有分布；对于TaCIPKs，只有TaCIPK2和TaCIPK31定位于细胞膜，其余在整个细胞中均有分布。 2.前期研究发现，TaCIPK5在小麦与条锈菌互作过程中的表达趋势与TaCBL4的基本一致。进一步研究表明，细菌鞭毛蛋白flg22和条锈菌候选效应蛋白Pst322处理小麦时，TaCBL4和TaCIPK5呈现相同的表达模式。由此推测TaCBL4与TaCIPK5形成TaCBL4/TaCIPK5复合体参与了小麦对条锈菌的PTI（PAMP-triggered immunity，PTI）过程。利用酵母双杂交技术、BiFC技术和Co-IP技术进一步验证了TaCIPK5与TaCBL4确实存在互作，并且TaCIPK5的NAF基序决定了二者的互作关系。利用BSMV（Barley stripe mosaic virus，BSMV）介导的基因沉默技术技术（Virus induced gene silencing，BSMV-VIGS），在小麦中分别瞬时沉默TaCBL4和TaCIPK5后，与对照相比，沉默植株中受条锈菌诱导的ROS积累量和细胞坏死面积减少，PR基因的表达水平显著降低，而ROS的清除相关基因的表达量显著升高。当共沉默TaCBL4和TaCIPK5并接种条锈菌后，共沉默植株抗病表型与TaCBL4或TaCIPK5单沉默植株表现一致。进一步利用酵母双杂筛选发现TaCIPK5与ROS合成相关蛋白TaRbohi存在互作，并且在TaCBL4、TaCIPK5单沉默或TaCBL4/TaCIPK5共沉默植株中TaRBOHi表达均显著下降。以上所有结果表明，小麦TaCBL4和TaCIPK5组成蛋白复合体TaCBL4/TaCIPK5，通过调控寄主ROS信号通路参与了小麦对条锈菌的抗病性。 3.为进一步揭示CBL-CIPK通路与SA信号通路的关系，对已克隆出的小麦CIPK基因进行了SA处理下的转录表达特征分析，发现只有TaCIPK10能够受到SA的诱导表达，暗示了TaCIPK10可能通过调控SA信号通路发挥作用。体外磷酸化实验发现，TaCIPK10的蛋白激酶活性受到TaCBL4和钙离子的共同调控。利用BSMV-VIGS技术沉默TaCIPK10后，接种条锈菌非亲和小种CYR23后，沉默植株上产生了少量的孢子堆，同时条锈菌诱导的ROS积累、坏死面积及PR基因的表达均显著降低。进一步利用转基因技术构建了TaCIPK10过表达转基因材料，抗病性鉴定发现过表达材料对条锈菌的抗性显著提高，表现为接种亲和小种CYR32后，产孢量显著降低，条锈菌诱导的ROS积累、坏死面积及PR基因的表达均显著增强。由此说明了TaCIPK10在小麦对条锈病的抗性中起到正调控作用。进一步研究表明，在小麦中与拟南芥NPR3/4的同源蛋白TaNH2为TaCIPK10的互作靶标，并被TaCIPK10磷酸化。TaNH2蛋白的第518位氨基酸对TaCIPK10的磷酸化作用起到决定性作用。通过BSMV-VIGS实验证实了TaNH2正向调控小麦对对条锈菌的抗病性。以上所有结果表明，TaCIPK10在小麦抗条锈病过程中的作用部分或全部依赖于TaNH2。由此推测，在小麦与锈菌的互作过程中CBL-CIPK和SA信号通路存在交互对话。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1植物对病原菌的免疫机制

1.2 SA介导的抗病反应

1.3活性氧信号

1.4钙离子信号

1.5植物钙调神经磷酸酶B类蛋白与CBL互作蛋白激酶

1.6 条锈病的危害及研究现状

1.7本研究的目的意义

第二章 小麦TaCBL与TaCIPK基因家族的鉴定

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.3试验方法

2.4实验结果和分析

2.4结论与讨论

第三章 小麦TaCBL4-TaCIPK5蛋白复合体功能分析

3.1前言

3.2材料、试剂及仪器

3.3 实验方法

3.4结果与分析

3.5 结论与讨论

第四章 TaCIPK10介导的抗病机理的研究

4.1前言

4.2材料、试剂及仪器

4.3实验方法

4.4 结果与分析

4.4结论与讨论

第五章 全文结论与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

参考文献

附表一

附表二

附表三

致谢

作者简介