宿主ESCRT-III亚基CHMP7、IST1与Vps2A在AcMNPV出芽型病毒侵染中的作用

摘要

在真核细胞中，内吞体分选转运复合体（theendosomal sorting complex required for transport，ESCRT）包含5个不同生化特性的复合物：ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III与Vps4。其中，哺乳动物ESCRT-III复合体由CHMP2A、CHMP2B（酵母同源蛋白为Vps2），CHMP6（Vps20），CHMP3（Vps24），CHMP4A、CHMP4B、CHMP4C （酵母同源蛋白为 Snf7）四类核心蛋白及 CHMP1A、CHMP1B（Vps46），CHMP5 （Vps60），IST1、CHMP7等多个辅助亚基组成。ESCRT系统参与多泡体（multivesicular bodies，MVBs）形成、胞质分裂、质膜修复、核膜重构以及囊膜病毒的入侵与出芽释放等多种生物学过程，其中ESCRT-III复合物负责脂质双层膜的解离。杆状病毒为大分子双链DNA囊膜病毒，其代表种苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的研究较广泛深入。近期的研究发现，超表达宿主细胞ESCRT-III亚基Snf7、Vps2B、Vps20、Vps24、Vps46、Vps60的显性-负性（Dominant-negative ， DN)突变体或 RNA 干扰下调这些宿主基因的表达显著降低AcMNPV出芽型病毒（Budded virus，BV）的入侵以及感染性BV的产量。目前，关于ESCRT-III复合体其它组成亚基CHMP7、IST1、Vps2A在AcMNPV侵染中的作用尚不清楚。 在本文中，我们首先从Sf9细胞中克隆了草地贪夜蛾CHMP7，IST1及Vps2A基因。随后，采用定量PCR分析了AcMNPV感染草地贪夜蛾Sf9细胞不同时间（0-48 h）后宿主ESCRT-III亚基CHMP7、IST1与Vps2A基因的表达变化。结果表明，在AcMNPV侵染的早期阶段（1-12 h）CHMP7、IST1与Vps2A的转录水平显著上调，暗示这些ESCRT-III亚基可能与AcMNPV侵染有关。随后，我们构建了GFP标签的IST1、CHMP7 与 Vps2A 瞬时表达质粒及重组 bacmid。在瞬时转染的 Sf9 细胞中超表达GFP 标签的CHMP7、IST1 或 Vps2A 均显著降低了感染性 BV 的产量；进一步分析表明，超表达GFP标签的CHMP7、IST1或Vps2A显著降低了AcMNPV极早期或晚期启动子指导的报告基因的表达及病毒基因组DNA的累积数量；通过转染重组bacmid表达GFP标签的CHMP7、IST1或Vps2A，我们发现出芽型病毒粒子的释放数量显著减少。此外，双分子荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）结果表明CHMP7、IST1和Vps2A与多个杆状病毒核心（或保守）蛋白Ac11、Ac76、Ac78、Ac80（GP41）、Ac93、Ac103、Ac142及Ac146存在相互作用。我们推测，CHMP7、IST1与Vps2A通过与 AcMNPV 蛋白形成复杂相互作用网络参与调控出芽型病毒的入侵和出芽释放过程。

目录

声明

第一章文献综述

1.1 ESCRT复合体及其功能

1.1.1 ESCRT-0

1.1.2 ESCRT-I

1.1.3 ESCRT-II

1.1.4 ESCRT-III

1.1.5 Vps4复合体

1.1.6 ESCRT系统辅助蛋白（Alix）

1.2 ESCRT复合体与病毒侵染关系

1.2.1 ESCRT复合体在病毒入侵中的作用

1.2.2 ESCRT复合体在病毒出芽释放中的作用

1.3 杆状病毒侵染机理

1.3.1 杆状毒概述

1.3.2 杆状病毒侵染周期

1.3.3 ESCRT复合体调控杆状病毒入侵与出芽释放研究进展

1.4 研究目的与意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1 昆虫细胞，菌株与质粒

2.1.2 常用试剂盒及相关试剂

2.1.3 大肠杆菌培养基及其他相关溶液

2.2 方法

2.2.1 制备感受态细胞

2.2.2 克隆草地滩夜蛾ESCRT-III亚基基因

2.2.3 瞬时表达质粒构建

2.2.4 重组bacmid构建

2.2.5 实时定量PCR

2.2.6 瞬时表达质粒提取、转染及激光共聚焦显微镜观察

2.2.7 病毒缺失补偿实验

2.2.8 AcMNPV出芽释放分析

2.2.9 AcMNPV启动子指导基因表达及基因组DNA复制分析

2.2.10 双分子荧光互补检测

2.2.11 Western blot分析蛋白表达

第三章结果与分析

3.1草地贪夜蛾IST1、Vps2A、CHMP7基因克隆

3.2 IST1、Vps2A、CHMP7基因在AcMNPV感染Sf9细胞中的转录水平分析

3.3 IST1、Vps2A、CHMP7的表达

3.4 过表达GFP标签的IST1、Vps2A、CHMP7显著降低感染性BV的产量

3.5过表达GFP标签的IST1、Vps2A或CHMP7对病毒早期侵染阶段的影响

3.6过表达IST1-GFP、Vps2A-GFP、CHMP7-GFP对AcMNPV出芽释放的影响

3.7 IST1、Vps2A、CHMP7与AcMNPV侵染关键蛋白的互作

第四章 结论与讨论

参考文献

致谢

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