CTP合成酶在小鼠大脑皮质发育过程中的作用及机制研究

摘要

哺乳动物新皮质是由产生于皮质不同发育时期的兴奋性投射神经元从室带迁移到达软脑膜而形成的规则的六层结构。其中，早出生的神经元定位于皮质深层，而晚出生的神经元越过早出生的神经元定位于皮质浅层从而形成新皮质“由内而外”的层状构筑。哺乳动物新皮质结构及功能的完整性是在神经祖细胞的增殖、分化及神经元迁移等的精密调控下实现的，其中任何一步出错都会引起神经系统疾病，如：癫痫、智力发育迟缓等。 三磷酸胞苷合成酶（CTP synthase, CTPs）是一种代谢酶，能够催化CTP的从头合成。在真核及原核生物细胞内，CTPs能够聚合形成更高级的结构，称为“细胞蛇”。细胞内“细胞蛇”结构的形成是细胞响应逆境变化及酶调控自身活性的一种方式。体外培养的哺乳动物细胞在谷氨酰胺剥夺后会诱导细胞内“细胞蛇”结构的形成，而CTPs在形成“细胞蛇”结构的过程中，酶的催化活性位点被掩盖从而导致细胞内催化合成CTP的活性降低。细胞内CTPs的表达水平在“细胞蛇”的形成过程中也发挥着重要作用。研究表明，在果蝇视神经叶上皮细胞中过表达CTPs会诱导“细胞蛇”结构的形成，并阻碍神经上皮细胞向神经祖细胞的分化，损害果蝇视神经叶的发育。随着越来越多的代谢酶被发现能够形成高级聚合结构以及先进仪器设备的应用，“细胞蛇”结构参与细胞代谢的生理功能得到了很好地阐明。但到目前为止关于“细胞蛇”结构的研究仍然停留在细菌、酵母等低等生物及体外培养的哺乳动物细胞内。 本研究我们以小鼠为动物模型，通过构建CTP合成酶-增强型绿色荧光蛋白（CTPs-EGFP）融合表达载体，结合子宫内电击转染、免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜拍照等技术手段，在体研究并分析CTPs在小鼠胚胎发育过程中对神经祖细胞增殖、分化及神经元迁移的影响，结果如下： 1. 小鼠胚胎发育过程中CTPs在小鼠大脑皮质持续表达。过表达CTPs在体诱导不同聚合阶段“细胞蛇”结构的形成，分别是细-短的纤维状结构、粗-长的条棒状结构和环形结构； 2. “细胞蛇”结构的形成抑制神经元的迁移、但不改变迁移障碍的神经元的命运。通过形态分析及延长迁移时间发现神经元迁移的抑制与神经元顶突起延长及皮质发育过程中神经祖细胞增殖、分化及神经元迁移的发育进程延缓等两方面因素有关； 3. “细胞蛇”结构的形成促进神经祖细胞离开室带/亚室带进入中间带，打破神经祖细胞增殖-分化的平衡，促进神经祖细胞分化为神经元，同时抑制神经祖细胞的增殖。通过BrdU活体注射、BrdU/Ki67双标及磷酸化组蛋白标记发现“细胞蛇”对神经祖细胞增殖的抑制与祖细胞的分裂活性受限有关，而与祖细胞细胞周期退出无关； 4.“细胞蛇”结构的形成对神经祖细胞增殖的抑制作用发生在细胞周期的特定时期。通过BrdU活体注射标记不同分裂周期的祖细胞发现“细胞蛇”对神经祖细胞增殖的抑制主要发生在S期和G2/M期；在G1期，祖细胞内“细胞蛇”结构解聚，对神经祖细胞增殖的抑制作用解除。

目录

声明

第一章 小鼠大脑皮质发育

1.1 神经干细胞的增殖、分化

1.2 神经元的迁移

1.3 胚胎小鼠神经发生过程中的细胞周期调控

第二章 CTPs的研究概况

2.1 CTPs的结构与功能

2.2 CTPs的活性及其调节

2.3 CTPs单体聚合形成高级结构

2.4 CTPs与疾病

2.5 CTPs与神经系统发育

第三章 过表达CTPs诱导“细胞蛇”结构的形成

3.1 材料方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 过表达CTPs对小鼠大脑皮质发育过程中神经元迁移的影响

4.1 材料方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 过表达CTPs对神经干细胞增殖和分化的影响

5.1 材料方法

5.2 结果

5.3 讨论

5.4 小结

第六章 过表达CTPs对神经祖细胞增殖的抑制作用具有细胞周期依赖的特性

6.1 材料方法

6.2 结果

6.3 讨论

6.4 小结

结论

参考文献

致谢

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