TET蛋白对玻璃化冷冻卵母细胞DNA甲基化和羟甲基化的影响

摘要

卵母细胞玻璃化冷冻在优良家畜种质资源保存、胚胎工程研究以及人类辅助生殖中越来越被广泛应用。但是，玻璃化冷冻-解冻过程中，卵母细胞要经历剧烈的环境应激，造成卵母细胞DNA甲基化降低、DNA损伤和细胞超微结构损伤，对卵母细胞的复苏、受精和胚胎发育带来了不利影响。本研究根据课题组的前期研究发现，卵母细胞冷冻引起卵母细胞解冻后甲基化水平总体下降。为了解析卵母细胞冷冻引起甲基化水平降低的原因，通过利用免疫荧光染色技术、qRT-PCR技术、RNAi等，检测在玻璃化冷冻-解冻过程中，主动去甲基化TET 1/2/3蛋白变化以及5-mC和5-hmC的动态变化。同时利用两种小分子活性调控剂和siRNA对检测变化最明显的TET3蛋白活性和表达进行调控，研究TET3蛋白在玻璃化冷冻-解冻过程中对DNA甲基化和羟甲基化的影响。得到以下研究结果： 1、玻璃化冷冻-解冻0h、1h、2h后检测5-mC和5-hmC水平，两者水平在2h得到显著降低；同时，在玻璃化冷冻-解冻过程中，TET1/2 在这个过程中不会发生显著变化（P＞0.05），而TET3在2h时却得到显著增加（P＜0.05）。随后在玻璃化冷冻-解冻后0h， 1h，2h通过qRT-PCR检测TET相对基因表达，TET1相对基因表达量没有发生显著变化（P＞0.05）；TET2和TET3相对基因表达量在解冻复苏前期没有显著变化，在2h时检测，两者相对表达量得到显著提升（P＜0.05）。 2、在卵母细胞玻璃化冷冻和复苏过程中添加VC，2h后检测5-mC和5-hmC以及TET3基因表达变化。相对于未处理组，VC处理组不能显著提升TET3基因和蛋白表达水平和降低5-mC和5-hmC水平（P＞0.05）。同样在DMOG处理整个玻璃化冷冻和复苏过程中，与VC处理相似，DMOG不能显著影响TET3基因和蛋白表达和提高玻璃化冷冻之后MⅡ卵母细胞5-mC和5-hmC水平（P＞0.05）。GV期显微注射TET3 siRNA，体外成熟培养至MⅡ期，实施玻璃化冷冻。结果显示，TET3基因表达水平得到显著抑制（P<0.01），干扰组与未干扰组之间，5-mC 水平并未发生显著变化（P＞0.05），5-hmC水平得到显著提升（P＜0.05）。 结论：玻璃化冷冻 MⅡ期卵母细胞会造成 DNA 甲基化和羟甲基化水平显著下降，同时在三种TET蛋白中，TET3在玻璃化冷冻后的MⅡ期卵母细胞中的相对基因表达水平和蛋白表达水平会显著上升。TET 蛋白激活剂 VC和抑制剂 DMOG 并不能够改变TET3的相对基因表达和蛋白表达，因此玻璃化冷冻之后的 MⅡ期卵母细胞 DNA甲基化和羟甲基化水平也不会发生显著变化。通过TET3 siRNA能够影响玻璃化冷冻之后卵母细胞的DNA羟甲基化水平，使MⅡ卵母细胞羟甲基化水平显著提升。

目录

声明

第一章 卵母细胞玻璃化冷冻与TET蛋白介导DNA甲基化过程研究

1.1卵母细胞玻璃化冷冻

1.2 卵母细胞与胚胎DNA甲基化与羟甲基化

1.3卵母细胞和早期胚胎发育过程中TET蛋白介导的DNA去甲基化

第二章 冷冻-解冻过程中TETs表达和DNA甲基化和羟甲基化水平变化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 TET3对玻璃化冷冻卵母细胞DNA甲基化和羟甲基化水平的影响

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

全文结论

创新点以及后续研究工作

1、创新点

2、后续研究工作

参考文献

缩略词表

致谢

作者简介