条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料

摘要

小麦条锈病是由小麦条锈菌（Puccinia stiiformis f.sp.tritici）引起的小麦重大病害，在世界范围内危害严重。利用抗病品种进行防治仍然是目前最经济最有效的方式。然而，条锈菌毒性变异频繁，新的毒性小种出现使得抗病基因不断被克服，同时新的抗病品种的选育速度远远滞后于毒性小种的更新速度。因此，研究小麦条锈菌的致病机理，寻找新的病害防控策略刻不容缓。 小麦条锈菌作为活体寄生真菌，需要从活体细胞中吸收营养，并向寄主中分泌效应蛋白调控寄主的免疫反应，促进侵染。在锈菌与小麦的互作过程中的致病因子有很多，其中一类基因主要负责条锈菌的生长及致病能力，相对保守；另外一类能够分泌进入寄主的体内，通过调节寄主的免疫系统以促进病原菌侵染。效应蛋白是侵染过程中分泌到寄主中促进病原菌侵染的一类小分子蛋白，在长期的进化过程中，产生了可以被寄主特异识别并引起过敏性坏死反应的AVR蛋白和调节寄主免疫的其他效应蛋白。然而条锈菌中重要效应蛋白调控小麦的机理我们知之甚少。本研究选取锈菌富含甘氨酸丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1进行研究，分析其序列特点，解析其变异特征；利用瞬时表达、亚细胞定位、寄主诱导的基因沉默（Host-Induced Gene Silencing,HIGS）等方法，解析PstGSRE1的时空表达特征、毒性及无毒性功能；进一步通过蛋白互作技术获得其在小麦中的靶标蛋白并明确其靶标蛋白的功能。此外，本论文还利用寄主诱导的基因沉默技术（Host-Induced Gene Silencing,HIGS）靶向沉默小麦条锈菌致病因子PstCPK1基因，创制了持久抗条锈病的转基因抗病材料。取得的主要结果如下： 1.鉴定了1个小麦条锈菌富含甘氨酸和丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1。序列分析发现其N端含有具有分泌功能的信号肽，未发现保守结构域。qRT-PCR分析发现PstGERE1在侵染初期表达量显著上调。毒性功能分析表明其可抑制Bax诱导的PCD；可抑制由EtHAn引起的胼胝质累积及非亲和菌株诱导的活性氧累积。亚细胞定位分析表明该效应蛋白在寄主体内活动活跃，并且呈现一种活跃的流动现象; 2.瞬时沉默PstGSRE1，条锈菌的生长明显受到抑制，菌丝长度，菌落面积及吸器数量减少，产孢的数量和面积大幅减少。表明该效应蛋白对于锈菌毒性具有重要作用。通过构建PstGSRE1的RNAi转基因沉默载体，基因枪法获得该基因的永久沉默转基因植株，经过多代的抗病选育，在T4代获得3个抗病性提高的转基因株系（L33、L34、L43），以上结果表明PstGSRE1是条锈菌重要的致病因子; 3.为了解析该效应蛋白在调控寄主免疫反应的机理，我们利用酵母双杂交系统筛选到了PstGSRE1的候选靶标蛋白，分别为TaLOL2、TaCAT1、TaCAT3、TaCIPK10等。利用酵母双杂交系统确认该效应蛋白与TaLOL2的C端互作，并进一步利用Pull-down技术和Co-IP技术确认了PstGSRE1与TaLOL2的互作关系; 4.序列分析发现，效应蛋白靶标TaLOL2含有三个锌指结构，该结构具有结合DNA的功能，在小麦中高度保守；存在3个拷贝，分别在5A、5B、5D上，且不同拷贝间相似性达96%以上。利用BSMV-VIGS技术瞬时沉默TaLOL2发现沉默植株对小麦条锈菌的抗病性显著降低，活性氧和坏死面积显著减少。利用T3SS系统在小麦中过表达该蛋白能够显著降低孢子堆的数量，表明其为小麦抗条锈病的正向调控因子；通过小麦原生质体定位技术发现TaLOL2具有明显的核定位信号，并能在烟草中引起细胞死亡。 5.PstGSRE1可以抑制TaLOL2诱导产生的坏死。荧光标记两个基因发现：在烟草中，TaLOL2在核中具有明显的累积，然而在效应蛋白存在的情况下，TaLOL2主要在细胞质中累积，导致其无法进入细胞核启动寄主免疫反应。表明条锈菌效应蛋白PstGSRE1通过干扰TaLOL2进核，从而抑制寄主免疫反应而利于病菌的侵染。; 6.鉴定了小麦条锈菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亚基PstCPK1。qRT-PCR分析发现，PstCPK1在条锈菌侵染初期表达量逐渐升高，18h达到峰值，随后逐渐降低。利用PstCPK1互补稻瘟菌CPK1突变体可以部分恢复其致病力。利用BSMV-HIGS瞬时沉默PstCPK1显著降低了条锈菌的毒性，组织学观察也发现病菌菌丝长度和菌落面积均显著下降。我们进一步构建PstCPK1永久沉默载体，通过基因枪转化法对小麦品种西农1376进行遗传转化，所获得的株系利用PCR鉴定并对阳性植株进行加代。经过多代抗病选育，在T4代获得2个抗病性提高的阳性转基因株系（L12和L18），并对插入小麦基因组的载体和所产生的小RNA分子进行分子鉴定，进一步明确了转基因株系的组织细胞学和分子水平的变化，初步探究了转基因株系的抗病分子机制。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1小麦条锈病

1.2条锈菌的生活史和侵染循环

1.3植物的免疫反应

1.4病原真菌的致病因子

1.5 小麦对条锈病的抗性

1.6本研究的目的和意义

第二章 条锈菌重要效应蛋白PstGSRE1功能鉴定

2.0前言

2.1材料、试剂及仪器

2.2试验方法

2.3试验结果

2.4结论与讨论

第三章 小麦条锈菌重要效应子PstGSRE1调控小麦中靶标TaLOL2的免疫机理

3.0前言

3.1材料、试剂及仪器

3.2试验方法

3.3试验结果

3.4结论与讨论

第四章 利用HIGS技术构建小麦持久抗条锈病材料

4.0前言

4.1材料、试剂及仪器

4.2试验方法

4.3结果与分析

4.4结论与讨论

第五章 全文结论

附录

参考文献

致谢

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