KLF3和KLF15基因对牛前体脂肪细胞分化和脂质代谢调控研究

摘要

牛肉作为一种高蛋白、低胆固醇的肉类食品深受人们喜爱，其嫩度和风味受肌内脂肪含量影响。动物体内脂肪的形成与沉积受多种转录因子调控，并且和脂肪细胞的分化和脂质代谢紧密相关。KLF转录因子家族（Krupple-like factors,KLFs）是锌指转录因子家族成员，在调控动物生长发育、细胞增殖、分化和凋亡方面起着重要作用，尤其在脂肪细胞的分化和脂质代谢过程中起重要调控作用。哺乳动物KLF家族共有17个成员分别命名为KLF1-KLF17；其中KLF3和KLF15作为其家族中的成员在脂肪细胞分化和脂质代谢中具有重要作用，但目前关于其对牛前脂肪细胞分化和脂质代谢的影响及其调控机理仍不清楚。 为了探索牛KLF3和KLF15基因对牛脂肪细胞分化和脂质代谢的调控作用，本实验选取西北农林科技大学选育的秦川牛肉用新品系初生犊牛前体脂肪细胞为研究对象，以腺病毒介导的过表达技术和干扰RNA技术为手段，通过细胞和分子水平进行研究。同时，在转录水平上初步探索牛KLF3和KLF15之间的调控作用，及它们对脂肪细胞分化和脂质代谢等关键的相关基因的影响。 本实验从细胞水平和分子水平研究KLF3和KLF15基因的在脂肪细胞分化和脂质代谢调控机制，取得如下结果： 1、KLF3基因新生牛和成年牛的瘤胃脂肪组织中表现为高丰度表达，而在肌肉组织中表达量很低，说明该基因可能在调控牛脂肪细胞分化和脂质代谢中具有重要作用。KLF15基因在新生牛和成年牛肾、肝脏和脂肪中高表达，而在肺中表达量很低，揭示KLF15基因也在脂肪细胞分化和脂质代谢中具有重要作用。 2、通过构建牛KLF15基因的腺病毒过表达载体，建立了适合于牛前体脂肪的腺病毒过表达载体系统。筛选得到高干扰KLF15表达效率RNA并建立适合于牛前体脂肪的干扰体系。过表达KLF15基因发现脂肪细胞分化关键基因PPARγ和C/EBPα表达量上调，而脂质代谢关键基因FAS和ACCα的表达量也显著上调（P<0.05）。而干扰KLF15基因这些关键基因表达量显著下调（P<0.05）油红O染色和甘油三酯含量测定发现过表达KLF15基因促进牛脂肪细胞中甘油三酯的积累，干扰KLF15基因抑制牛脂肪细胞中甘油三酯的积累。 3、筛选得到高干扰效率的KLF3的siRNA,干扰KLF3处理2d干扰效率达到73%并且在蛋白水平也显著下调，因此可用于后续的干扰实验。将Si-KLF3转染至牛前脂肪细胞后诱导分化至第4d发现脂肪细胞分化关键基因PPARγ和C/EBPα表达量下调(P<0.05)，而脂质代谢关键基因FAS、ACCα和FABP4的表达量也显著下调(P<0.05)。并且油红O和甘油三酯含量测定发现在牛脂肪细胞中干扰KLF3基因抑制甘油三酯的积累。 4、牛KLF3基因启动子只有1个转录起始位点，并且位于翻译起始位点（ATG）上游39bp。我们将其定义为+1，与已报道KLF3mRNA序列(NM_001205978.1)转录起始位点相比，我们将KLF3基因mRNA序列的转录起始位点在原有基础上向前推进6bp。克隆得到牛KLF3基因5'侧翼序列在-594，-376和-114bp处分别发现了三个多态位点，得到8种单倍型，其中Hap7/7组合型与其他组合型相比有更高的肌内脂肪含量，而且将不同单倍型连接至pGL3-basic后检测启动子区荧光素酶活发现H7单倍型具有更高的启动子酶活，这也说明启动子区的多态，影响了基因的启动子转录活性从而进一步影响了肉质性状。 5、牛KLF3基因启动子缺失片段的荧光素酶活性分析表明，KLF3基因核心启动子区域位于-264～-76bp，而且发现KLF3启动子有三个KLF15结合位点。并且位于其核心启动子区域内有一个KLF15结合位点。过表达KLF15载体和对照（Ad-CMV-NC）转染到牛原代脂肪细胞后发现过表达KLF15基因，KLF3基因的逐段缺失片段的启动子活性增强，另外通过RNA干扰（siRNA）和定点突变KLF15结合位点实验，分别共转染质粒pGL3-264/-76和KLF15siRNA、以及对照（si-NC）以及KLF15结合位点的点突变pGL3-264/-76质粒转染至牛原代脂肪细胞。研究发现，与对照组相比，KLF15siRNA组和点突变KLF15结合位点组的pGL3-264启动子活性下降。说明KLF15在牛脂肪细胞中促进KLF3启动子的转录活性。干扰牛KLF3基因，牛KLF15基因在转录水平显著下调，这也说明KLF3基因对KLF15基因存在正向调节作用，而具体的作用机制也许是由于micRNA共同调节KLF3和KLF15基因而造成的。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 研究背景

1.2 脂肪细胞分化和脂质代谢研究进展

1.3 KLF家族成员的发现、命名及结构

1.4 基因功能研究常用方法

1.5本研究的目的、意义和内容

第二章 牛KLF3和KLF15基因在牛不同组织的特异性表达分析

2.1 材料和方法

2.2 结果分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 牛KLF15 基因过表达载体包装和siRNA筛选

3.1材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 牛KLF15基因牛脂肪细胞分化和脂质代谢的作用

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4小结

第五章 牛KLF3基因对牛脂肪细胞分化和脂质代谢的作用

5.1材料和方法

5.2 结果

5.3讨论

5.4 结论

第六章 牛KLF3基因表达及SNPs与秦川牛脂质沉积的关联分析

6.1材料和方法

6.2 结果

6.3 讨论

6.4 小结

第七章 牛KLF15基因 对KLF3基因的转录调控研究

7.1 材料和方法

7.2结果

7.3 讨论

7.4 小结

第八章 结论及创新点

8.1结论

8.2创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介