水稻OsFROs基因分子表征及其在逆境条件下的表达特性分析

摘要

铁还原氧化酶(FRO)基因家族广泛存在于植物中，在维持植物体内金属离子的稳态、植物对金属离子的耐受性以及其他复杂的信号网络中扮演着重要角色，通过参与各类生物学过程来响应一系列的非生物胁迫反应。铁氧化还原状态的快速变化，可以在某种程度上刺激细胞功能的发挥，调节细胞的氧化还原平衡、电子传递过程以及其他新陈代谢过程。与此相反，铁毒性却具有高度的反应活性，可以阻碍植物正常的生长和发育过程。早期研究表明，FROs在维持铁离子(Fe)的稳态、Fe的吸收和转运机制中起重要作用，但其进化历史和核心功能位点仍不清楚，特别是在水稻中研究地更少。本研究初步分析了水稻FRO基因家族的系统发育关系，明确了水稻FRO基因的表达特征，然后利用遗传转化、形态学分析及生理测定等方法对水稻OsFRO1基因在胁迫响应过程中的功能进行了较深入的研究，取得的主要结果如下： 1、为了探索FROs家族的系统发育关系，首先检索了代表植物亚群的8个主要世系（即蓝绿藻、红藻、绿藻、苔藓类、石松类、裸子植物、单子叶植物和真双子叶植物）中的16个不同物种，从中鉴定到了50个植物类FROs基因和15个非植物体的类铁还原氧化酶(FRO-likes)基因，这些FROs在系统发育上高度保守，生物学功能类似，可分为7个相对保守的亚家族。植物FRO家族成员和他们的同源基因可能来自于一个共同祖先，都拥有三个典型结构域：一个含血红素的跨膜区铁还原酶结构域(Pfam:PF01794)以及两个C-末端位于细胞质的FAD结合结构域(PF08022)和NAD结合结构域(PF08030)。在植物中，由于FROs基因家族外显子和内含子的数量相对较少，结构并不复杂，并且植物FROs基因在内含子的数量和相位上也十分保守。尽管内含子的位置在各个亚族中是不同的，但FAD和NAD结合结构域中分别与辅助因子结合的HPFT和GPYG基序在水稻OsFRO1和OsFRO7这两个基因中十分保守。相比较，这两个基因中的其他氨基酸序列保守性相对较差。这些结果表明，植物中FRO家族蛋白功能的多样性和分化可能是由于长期的进化历史导致的，基因复制增强了FRO家族基因的功能分化。 2、分析了水稻FROs基因的组织特异性表达模式以及胁迫和激素处理后的诱导表达特征。首先，在GENEVESTIGATOR V3数据库中调查了水稻FROs基因在各个发育组织中和应激条件下的一组微阵列表达数据，并通过水稻eFP浏览器对获得的数据进行准确性交叉验证。随后，通过定量RT-PCR和半定量RT-PCR分析发现，OsFRO1和OsFRO7基因在水稻各个组织中普遍表达，但OsFRO1在旗叶中表达量较高，OsFRO7在叶片和旗叶中也具有较高的表达量。进一步分析了OsFRO1和OsFRO7基因在非生物胁迫、激素诱导和金属离子处理条件下的表达模式。结果显示，OsFRO1基因在遭受盐胁迫和干旱胁迫时响应剧烈，OsFRO7基因在盐胁迫和热胁迫下表现出转录特异性，但两者在热胁迫下均无明显表达。重金属胁迫也能诱导这两个基因高表达。在Zn、Pb、Co和Ni处理6h后，OsFRO1基因转录即可被触发，而OsFRO7基因在Fe、Pb和Ni处理12h后、Zn和Cr处理6h后、Mn和Co处理3h后其表达开始出现上调。这些研究结果表明，这两个基因参与了多种胁迫响应及植物激素调控过程。 3、克隆了水稻的OsFRO1基因，并利用RNAi技术研究了其功能特征和胁迫响应机制。实验结果表明，OsFRO1主要定位于细胞膜上，在胞内其他细胞器中也有一些分布。与野生型水稻相比，OsFRO1-RNAi株系表现出种子萌发迟缓、植株生长受到阻滞、侧根和不定根数数目减少、植株矮化、节间变短、旗叶缺铁、叶绿素含量降低、ROS调节机制受到抑制等现象。此外，在多变量胁迫下，OsFRO1-RNAi植株在转录水平、生理和形态学方面也发生了一些变化。在OsFRO1-RNAi株系中，抗氧化酶表现为：MDA和APX活性升高，SOD、POD和CAT活性降低，表明在胁迫条件下OsFRO1基因下调可能有助于植株对胁迫条件的适应。从而抑制了侧根的形成，致使水稻产量下降。此外，在OsFRO1-RNAi株系中，由于缺铁，叶绿素含量和叶片色素也降低，导致植株的叶片衰老、褐变和叶绿素进一步降解。综上所述，FROs基因在植物生长发育中起重要作用FROs蛋白的亚细胞定位可能有助于Fe从外膜转移到内膜并进一步进行Fe分配。水稻中只有发现了两个FROs基因，具有不同的组织表达模式，对各种非生物胁迫和激素处理的响应方式也不尽相同。FROs基因表达的的精细调控对植物的生长发育至关重要，水稻FROs在旗叶中表达量高说明其在在籽粒灌浆和籽粒发育中具有重要作用。OsFRO1功能的丧失会引起植株对Fe胁迫的敏感性，显著影响了植株的正常生长和对胁迫条件的响应。