半夏连作障碍发生机制与轮作修复研究

摘要

半夏［Pinellia ternate(Thunb.)Beri.］，为天南星科半夏属多年生草本植物。以干燥块茎入药，具有降逆止呕、清热化痰、解毒抗炎、镇咳抗肿瘤功效，是中国现代中药产业链重点研究利用的大宗药材之一。但半夏在生产中存在严重的连作障碍问题，传统同一块地间隔7-8年以上才可复种，严重制约了区域经济、土地永续利用及相关产业的可持续发展。越来越多研究表明：半夏化感物质及根际微生物群落结构的破坏是其连作障碍形成的主要原因。因此，本研究以半夏连作—轮作系统中不同根区化感物质及微生物群落变化为重点进行研究，确定半夏连作地经轮作小麦后化感物质、微生物群落结构的变化规律，探明半夏潜在化感物质及根际微生物与连作障碍之间的关系，为缓解半夏连作障碍提供理论依据。 取得的主要研究结果： 1、轮作小麦3年基本恢复了半夏的生理指标、质量指标及有效成分含量。结果表明：小麦轮作3年，半夏各生长时段株高、叶面积均显著高于连作1年，倒苗率显著低于连作1年，与对照土壤相比无显著差异；轮作3年后半夏产量高于连作1年接近对照；轮作3年后，块茎中水分、酸不溶性灰、浸出物等质量标准高于连作1年，其中浸出物含量显著增加；可溶性糖、还原糖、琥珀酸、生物碱、鸟苷等有效成分质量分数高于连作1年，且可溶性糖含量显著增加。 2、确定了半夏根际土壤中的8种酚酸物质对半夏产生较强的化感作用。对连作3年半夏根际土壤和非连作土壤中的酚酸物质进行提取，LC-MS鉴定，共鉴识到17种酚酸类物质。经过对比和结合文献，确定了没食子酸、原儿茶酸、香草酸、丁香酸、香兰素、丁香醛、阿魏酸、绿原酸等8种物质可能对半夏生长发育产生较强的化感作用。进一步考察以上8种酚酸类物质对半夏发芽的影响，结果发现，有7种酚酸对半夏发芽率及萌发指数有抑制作用。阿魏酸对半夏发芽率具有促进作用，且随着浓度的增大，促进作用增强。 3、小麦与半夏轮作降低了半夏根际土壤中酚酸类物质的含量。采用HPLC方法分析了半夏连作-轮作系统根际与根面土壤中总酚酸和8种单一酚酸物质含量。结果表明，（1）半夏连作后，总酚酸含量随连作时间的延长而递增，与对照相比呈极显著差异；轮作小麦修复后，总酚酸显著减少，轮作根际土壤中总酚含量大于根面土壤。（2）轮作小麦降低了连作半夏土壤中各酚酸含量。半夏连作根际和根面土壤中8种单一酚酸含量均高于对照和轮作土壤；根面土壤中大部分酚酸低于根际土壤含量。与连作土壤相比，轮作后的7种酚酸平均含量降低了50%，并由根面向根际进行了动态迁移。各酚酸的变化与轮作年限之间呈现第1年降低，然后第2年逐渐升高，到第3年开始稳定的模式。 4、外源抗氧化剂抗坏血酸（ASC）或龙胆二糖（gentiobiose），可显著缓解连作半夏根际酚酸引起的化感效应，减少根尖活性氧的积累。（1）采用FDA/PI双染色法，研究8种酚酸混合物对半夏根系细胞活力和活性氧积累的规律，结果表明：混合酚酸胁迫半夏幼苗随着时间的延长活性氧积累递增，在4h后由于积聚大量的活性氧，根细胞完全凋亡。（2）在含有酚酸类物质的液体培养基中添加不同浓度的抗氧化剂抗坏血酸（ASC）或龙胆二糖（gentiobiose），测定过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性，以及ASC-GSH循环酶中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、半脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的活性，探讨外源抗氧化剂对8种酚酸混合物自毒作用的缓解机制。结果表明抗氧化酶SOD在抗坏血酸（ASC）处理36h和龙胆二糖（gentiobiose）72h时活性显著增强，使根系中大量积累的O2-自由基转化为H2O，从而减少根系活性氧的积累，减轻氧化损伤。外源性抗氧化剂（ASC和龙胆二糖）可能通过促进SOD活性和ASC-GSH循环酶（APX、DHAR和MDHAR）的增加，帮助根细胞清除酚酸胁迫导致的过度积累的ROS。 5、重点围绕半夏连作对根际细菌群落结构的变化系统研究，以及小麦-半夏轮作对已变化的群落体系修复展开分析和讨论。本研究利用试验地原始土壤，在温室环境下设计盆栽实验，并按时间顺序依次获得连作至轮作盆栽处理组的根际土样品，各样品分别代表连作不同时限根际土、以及轮作不同时限根际土。用Illumina PE300平台对土样进行测序。结果表明，随着连作时限的延长，细菌群落α-多样性水平呈下降趋势，连作土经轮作后，α-多样性水平开始升高，且轮作年限延长，多样性水平越高。表明连作会导致根际细菌群落组成趋于简单化，而轮作会使单一化的群落恢复多样化构成。在属水平归类这些OTUs（可操作分类单元）发现Pseudomonas、Rhizobium、和Streptophyta主要在连作体系中富集，并且连作1年至1年半的根际土中富集的OTUs以St-reptophyta为主，说明半夏种植半年（1茬），多数植物促生长菌会被“招募”至根际，但连作1年（2茬）至1年半（3茬），根部病变并开始腐烂，根内Streptophyta菌群开始渗入根际。此外，因无典型病原细菌OTUs被富集，推测根际细菌群落结构的巨大改变导致病原真菌“趁虚而入”，造成根腐烂。基于连作1年半土壤，使用小麦轮作半夏，发现经轮作后的根际中被富集的OTUs主要属于Rhizobium、Pseudomonas、Flavobacterium、Sphingomonas、Rhizobacter、和Arthrobacter属细菌，说明轮作可以使土壤中大量植物促生长菌回归半夏根际，促使根际微生物群落恢复正常。基于上述6类土样以及原始土间β多样性，可将所有土样根据群落组成特点归为3类，分别定义为健康土、病害胁迫土、和病害土，并且这三类土间理化特征和群落多样性具有显著性差异。使用MET AGENassist数据库预测这3类土活性微生物组发现，有木聚糖降解、固氮、几丁质降解等功能的细菌群在3类土壤中的分布存在明显差异。 6、利用Illumina PE300平台对真菌ITS2区域进行测序，结果表明真菌群群落多样性随连作时间的延长而降低。连作土经轮作后，真菌群落α-多样性得到回升，但α-多样性水平不会随轮作时限的延长而呈明显上升趋势，表明轮作可以适当恢复连作土中真菌群落多样化结构，但无法通过延长轮作时限来进一步达到增强群落多样性的效果。β-多样性分析表明，连作可使根际土真菌群落结构出现明显改变，但变化程度不随连作时限的延长而增强；连作1年半的土经轮作处理后，真菌群落结构基本恢复至连作半年时群落结构水平。所有土壤经聚类分析，发现原始土、连作土以及轮作土真菌群落结构基本上各自形成一个聚类群，聚类结果与连作或轮作时限无明显关系，说明真菌群落结构的形成主要与作物方式高度关联。CAP分析分别建立连作土样、轮作土样、以及所有土样中真菌群落与土壤理化参数间相关关系，结果发现蔗糖酶、多酚氧化酶、全钾等与连作系统中群落结构变化显著相关；全钾、有机碳与轮作系统中群落结构的变化显著相关；速效氮、全钾、速效钾等含量与所有土样间群落结构差异显著相关。使用二项分布的广义线性模型，分析连作、轮作、对照组丰度存在显著性差异的OTUs。结果表明，连作土会高度富集属于病原真菌的OTUs，并且这些OTUs中镰刀菌属的OTUs为优势类群；此外，一些分解纤维素、多糖类的有益真菌OTUs在连作中被抑制。一旦连作土经轮作处理后，病原真菌OTUs会被显著抑制，有益真菌OTUs丰度会得到显著提升。 综上所述，本研究证实了8种酚酸对半夏具有化感作用，与小麦轮作后这些酚酸物质由根面向根际进行了迁移的动态变化，降低了酚酸物质对半夏生长发育的危害；在此研究基础上添加外源抗氧化剂抗坏血酸（ASC）或龙胆二糖（gentiobiose），可显著缓解连作半夏根际酚酸引起的化感效应，减少根尖活性氧的积累。本研究还证实了与小麦轮作可修复因半夏连作导致的微生物群落结构变化，轮作可以使土壤中大量能促进植物生长的细菌回归半夏根际，根际土壤中病原真菌OTUs被显著抑制，有益真菌OTUs丰度显著提高。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1连作障碍发生及其机制

1.1.1连作障碍

1.1.2连作障碍产生的机制

1.2.1 轮作在缓解药用植物连作障碍中的应用

1.2.2轮作对微生物群落的影响

1.2.3轮作对土壤理化性质及养分状况的影响

1.2.4 轮作对自毒作用的影响

1.3 半夏连作障碍的研究现状

1.3.1 半夏连作障碍

1.3.2半夏连作障碍产生的原因

1.3.3半夏连作障碍研究中存在的问题

1.4.1目的意义

1.4.2 研究内容

2.1 引言

2.2.1 试验地概况

2.2.2 试验设计

2.2.3 测定指标与方法

2.3.1小麦轮作对半夏株高的影响

2.3.2小麦轮作对半夏叶面积的影响

2.3.3小麦轮作对半夏倒苗率的影响

2.3.4轮作对半夏块茎产量的影响

2.3.5对半夏块茎水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的影响

2.3.6对半夏块茎中可溶性糖、还原糖、琥珀酸、生物碱、鸟苷代谢物的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 半夏连作根际土壤中自毒酚酸物质的分离鉴定及其对半夏的化感作用

3.1 引言

3.2.1试验材料

3.2.2试验设计

3.2.3样品溶液制备方法

3.2.4 色谱及质谱条件

3.2.5 酚酸对半夏种茎萌发的影响

3.2.6仪器与试剂

3.2.7 数据分析

3.3.1连作半夏根际土壤中酚酸类化感物质成分鉴定

3.3.2 对照土壤中酚酸类化感物质成分

3.3.3半夏连作根际土壤与对照土壤酚酸类化感物质比较

3.3.4半夏连作根际土壤中酚酸对半夏的化感作用

3.4 讨论

3.5小结

4.1 引言

4.2.1试验材料

4.2.2试验设计

4.2.3 半夏土壤总酚含量的测定

4.2.4半夏根际土壤中各酚酸物质的测定

4.2.5仪器与试剂

4.2.6数据统计与分析

4.3结果与分析

4.3.1轮作小麦对半夏根际和根面土壤中总酚酸含量的影响

4.3.2半夏连作-轮作系统中土壤自毒酚酸物质的含量与变化

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 外源抗氧化剂对半夏根际土壤酚酸自毒效应的缓解作用及机理

5.1 引言

5.2.1供试材料及仪器

5.2.2试验设计

5.2.3 测定项目

5.3数据分析

5.4 结果与分析

5.4.1半夏连作根际土壤中酚酸对半夏幼苗生长发育的影响

5.4.2 混合酚酸协同处理引起半夏根细胞死亡和细胞壁退化

5.4.3外源抗氧化剂对混合酚酸胁迫下半夏根系氧化酶系统的影响

5.5讨论

5.6 小结

第六章 轮作小麦对连作半夏土壤中细菌修复研究

6.1引言

6.2.1 土壤采样地

6.2.2 实验方法

6.2.3 PCR扩增与16S rRNA基因测序

6.2.4 序列分析

6.2.5统计分析

6.3 结果与分析

6.3.1土壤理化特征与植株鲜重

6.3.2细菌鉴定与群落分布

6.3.3细菌群落成分与群落多样性

6.3.4细菌群落与环境因素间的关系

6.3.5连作、轮作中与不同时期关联的差异性OTUs筛选

6.3.6三个后验群的特征微生物分析

6.3.7三个后验群微生物代谢特征预测

6.4 讨论

6.5小结

7.1 引言

7.2.1 实验设计

7.2.2 PCR扩增与ITS2测序

7.2.3 序列分析

7.2.4 统计分析

7.3 结果与分析

7.3.1真菌鉴定与系统分布

7.3.2 真菌群落结构与多样性

7.3.3 真菌群落β-多样性分布

7.3.4 真菌群落结构与土壤理化因素间相关关系

7.3.5 连作-轮作系统中差异性OTUs筛选

7.3.6 连作/轮作系统指示菌群

7.4讨论

7.5 小结

第八章 结 论

创新点

研究展望

参考文献

附录

致谢

作者简历