我国枣食芽象甲种群遗传结构、适生性及种群历史动态研究

摘要

枣食芽象甲Scythropus yasumatsuiKono et Morimoto又名枣飞象，属鞘翅目象甲科(Coleoptera:Curculionidae)，是我国枣树上一种重要的灾害性害虫。该虫1977年首次在我国河南新郑、濮阳等地区被报道，近几十年来，受全球气候变化、枣树栽培面积增加、人类活动等因素的影响，其种群密度不断增加，分布区域逐渐北移，目前已在新疆、宁夏部分地区发生，为害程度日趋严重。 本研究以采自我国5个省份12个地理种群的枣食芽象甲样本为材料，利用微卫星、线粒体基因与核基因分子标记的方法，分析枣食芽象甲不同地理种群的遗传多样性和遗传结构，预测枣食芽象甲在我国的适生区域和适生关键环境因子，分析枣食芽象甲不同种群的历史动态，并预测其种群扩散来源及潜在扩散路径。主要研究结果如下： 一、基于转录组数据的枣食芽象甲微卫星位点筛选 利用二代测序技术对枣食芽象甲成虫进行转录组测序，并筛选适用于枣食芽象甲种群遗传学研究的微卫星位点。在枣食芽象甲转录组数据的171322条Unigene中发现2613个微卫星位点，二核苷酸与三核苷酸重复为主要重复类型，分别占微卫星位点总数的48.22%和46.12%。在二核苷酸重复微卫星中，AT/TA为优势重复基元；在三核苷酸重复微卫星中，AAT/ATT为优势重复基元类型，且微卫星重复单元的重复次数主要分布在5-12次之间。基于筛选得到的微卫星位点，利用Primer Premier5设计出50对微卫星引物，最终开发出16个具有多态性的微卫星位点，可用于枣食芽象甲的种群遗传多样性和遗传结构研究。 二、枣食芽象甲线粒体基因组全序列测定与系统发育研究 利用二代测序技术测定出枣食芽象甲线粒体基因组全序列，序列全长16472bp，DNA为闭合双链，包括13个PCGs基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因，另外含有2段较长的非编码区。利用13个蛋白质编码基因核苷酸序列建立贝叶斯系统发育树，明确枣食芽象甲与其它近缘的7个亚科12个物种的系统发育关系，结果表明枣食芽象甲与同属于粗喙象亚科Entiminae的大灰象甲亲缘关系最近。 三、基于微卫星的枣食芽象甲种群遗传多样性与遗传结构研究 利用8个微卫星位点对我国5个省份（山西、陕西、宁夏、河北和河南）12个地理种群的371头枣食芽象甲样本进行种群遗传多样性和遗传结构分析。结果表明我国枣食芽象甲种群具有较高的遗传多样性，各位点的有效等位基因数(Ne)为2.113~8.016，等位基因丰富度(Ar)为2.648~5.665，多态信息含量(PIC)为0.561~0.908，期望杂合度(He)为0.476~0.865；种群间遗传分化系数(Fst)平均值为0.151；基因流(Nm)平均值为1.594。基于UPGMA和NJ系统进化树、主成分分析与STRUCTURE分析3种方法均支持将12个地理种群分为3组，组1包括陕西神木、陕西佳县、陕西清涧、陕西延川、山西临县、山西柳林与山西永和种群，组2包括河北沧县与河南新郑种群，组3包括陕西阎良、河南灵宝与宁夏同心种群。各组之间受太行山脉、黄土高原等地理隔离的影响，存在明显的遗传结构。其中组1这7个种群间的Nm平均值为6.258，表明它们具有高度的基因交流。Mantel检验结果表明，枣食芽象甲各种群间的遗传距离与地理距离之间呈显著正相关关系。 四、基于线粒体与核基因的枣食芽象甲种群遗传多样性与遗传结构研究 利用线粒体（COI、COII和Cytb）和核基因（ITS1和ITS2）分子标记分析9个地理种群的枣食芽象甲样本的遗传多样性，计算得出各种群的线粒体单倍型多样性平均值为0.527，核苷酸多样性平均值为0.0018；ITS序列单倍型多样性平均值为0.318，核苷酸多样性平均值为0.0005，单倍型多样性高（Hd>0.5），核苷酸多样性低（π<0.005）的特征表明枣食芽象甲为古老群体，可能在第四纪冰期时曾经历过瓶颈效应。基于单倍型数据，通过系统进化树、邻接网络图和BAPS3种方法分析枣食芽象甲种群的遗传结构，结果表明，枣食芽象甲各种群间形成了明显的系统地理结构。线粒体单倍型支持将枣食芽象甲9个地理种群分为5个分支，而ITS单倍型结果与微卫星相同，支持将不同种群分为3个分支。各地理种群的遗传分化与基因流分析结果表明，陕西和山西黄河谷地区域的各种群间不存在遗传分化，黄河没有成为种群间基因交流的地理障碍，这与微卫星的研究结果相同。 五、枣食芽象甲在我国的适生性与适生环境因子分析 利用MaxEnt生态位模型，结合枣食芽象甲在我国的分布区域，以及末次间冰期（LIG）、末次盛冰期（LGM）、现代和未来4个时期的Worldclim全球气象环境数据，预测枣食芽象甲在我国不同历史时期的潜在适生区，并预测出末次盛冰期前后的太行山脉东部华北平原地区、陕西渭河谷地和山西汾河谷地这3个区域始终为枣食芽象甲的适生区域，推测这些区域可能为枣食芽象甲在第四纪冰期的避难所。利用2070年的气候环境因子进行枣食芽象甲的适生性分析表明该虫的适生区域有在未来继续北移的趋势，内蒙、辽宁、新疆、甘肃和宁夏等地都将成为枣食芽象甲的适生区。通过Jackknife分析法得出影响枣食芽象甲分布最重要的环境因子是温度，冬夏温差较大且气候干燥的环境条件最适宜枣食芽象甲的发生。 六、枣食芽象甲种群历史动态及扩散路径分析 利用BEAST估算出枣食芽象甲种群的最初分歧时间在2.54Ma（百万年）左右，错配分布分析和中性检验结果表明，枣食芽象甲有5个地理种群的错配分布为单峰模式，Tajima′s D和Fu′s Fs中性检验值在这几个种群达到显著水平（P<0.05），证明枣食芽象甲曾经历过种群扩张，扩张时间从末次间冰期开始，到末次冰期后结束(0.012-0.15Ma)，贝叶斯天际线分析（BSP）也得到相似的结论。使用Migrate-n对种群间的历史迁移率进行分析，推测出可能的扩散起源地有2个：山西吕梁和河南灵宝，目前已扩散至河北沧县、陕西榆林和宁夏同心等种群所在地区。使用ArcGIS的SDMtoolbox工具中的最低成本路径法（LCP），结合枣食芽象甲分子标记数据和地理分布数据，预测枣食芽象甲在我国的潜在扩散路径。结果表明，黄河中下游谷地区域是枣食芽象甲种群最可能的扩散通道。 本研究为阐明我国枣食芽象甲的种群遗传结构，了解其在我国的分布和扩散趋势提供了理论依据，为揭示其成灾规律和制定综合防治策略提供了重要参考，同时也为研究其对环境、寄主及人类活动的适应性和进化机制提供了帮助。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 我国枣食芽象甲研究概述

1.1.1 我国枣树分布及病虫害现状

1.1.2 我国枣食芽象甲分布概况

1.1.3 枣食芽象甲生物学特征

1.1.4 枣食芽象甲的研究现状

1.2.1 种群遗传多样性及遗传结构概念

1.2.2 遗传多样性与遗传结构的影响因素

1.2.3 遗传多样性与遗传结构的研究方法

1.2.4 遗传多样性及遗传结构的研究意义

1.3.1 分子系统地理学概念

1.3.2 分子系统地理学重要理论

1.3.3 分子系统地理学研究方法

1.3.4 分子系统地理学的研究应用

1.4 物种生态位模型研究

1.4.1 生态位的概念和发展

1.4.2 生态位模型的概念和类型

1.4.3 生态位模型的研究应用

1.5.1 研究目的意义

1.5.2 研究技术路线

第二章 基于转录组数据的枣食芽象甲微卫星位点信息分析

2.1.1 供试成虫

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 成虫总RNA的提取

2.1.4 cDNA文库构建及转录组测序

2.1.5 转录组数据组装分析及微卫星筛选

2.1.6 成虫基因组DNA提取及质量检测

2.1.7 微卫星引物设计及PCR扩增

2.1.8 非变性聚丙烯酰胺电泳及T载体连接转化

2.2 结果与分析

2.2.1 转录组序列组装及注释

2.2.2 微卫星位点在转录组中的分布特征

2.2.3 微卫星引物PCR扩增

2.2.4 非变性聚丙烯酰胺电泳及连接转化引物筛选

2.3 讨论

第三章 枣食芽象甲线粒体基因组全序列测定与系统发育研究

3.1.1 供试成虫

3.1.2 主要仪器和试剂

3.1.3 成虫基因组DNA提取及质量检测

3.1.4 DNA文库构建及测序

3.1.5 数据预处理及线粒体基因组序列拼接和鉴定

3.1.6 基因功能注释和全基因组圈图绘制

3.1.7 系统发育分析

3.2 结果与分析

3.2.1 线粒体全基因组结构

3.2.2 线粒体基因组蛋白质编码基因特征

3.2.3 线粒体基因组非编码区特征

3.2.4 枣食芽象甲系统发育关系研究

3.3 讨论

第四章 基于微卫星的枣食芽象甲地理种群遗传多样性及遗传结构研究

4.1 材料与方法

4.1.1 供试成虫及采样信息

4.1.2 试剂和仪器

4.1.3 基因组DNA提取及质量检测

4.1.4 微卫星荧光标记引物的合成及PCR扩增

4.1.5 毛细管电泳基因分型

4.1.6 种群遗传多样性分析

4.1.7 种群遗传结构分析

4.2 结果与分析

4.2.1 荧光标记PCR扩增结果检测

4.2.2 微卫星位点基因分型分析

4.2.3 哈迪-温伯格平衡检验

4.2.4 微卫星位点的无效等位基因频率

4.2.5 微卫星位点的遗传多样性分析

4.2.6 微卫星位点的等位基因频率

4.2.7 不同地理种群的遗传多样性分析

4.2.8 不同地理种群的遗传分化和基因流分析

4.2.9 种群系统发育树分析

4.2.10 种群主成分分析

4.2.11 STRUCTURE结构分析

4.2.12 种群间遗传距离与地理距离的相关性分析

4.2.13 AMOVA分子方差分析

4.3 讨论

第五章 基于线粒体和核基因的枣食芽象甲地理种群遗传多样性和遗传结构研究

5.1.1 供试成虫

5.1.2 试剂和仪器

5.1.3 基因组DNA提取

5.1.4 线粒体基因引物筛选及PCR扩增

5.1.5 核基因引物筛选及PCR扩增

5.1.6 序列比对分析

5.1.7 种群遗传多样性分析

5.1.8 单倍型系统发育分析

5.1.9 种群遗传结构分析

5.2 结果与分析

5.2.1 PCR扩增及测序结果检测

5.2.2 基因序列变异统计和单倍型分析

5.2.3 地理种群的遗传多样性分析

5.2.4 单倍型在地理种群中的分布

5.2.5 地理种群的单倍型系统发育分析

5.2.6 地理种群的单倍型邻接网络分析

5.2.7 地理种群空间分组分析

5.2.8 地理种群遗传分化和基因流分析

5.3 讨论

第六章 枣食芽象甲在我国的适生性与适生环境因子分析

6.1 材料与方法

6.1.1 枣食芽象甲全国分布数据

6.1.2 环境变量指标的选取

6.1.3 MaxEnt模型适生性分析

6.1.4 模型评价和适生环境因子分析

6.1.5 不同时期适生区分布变化及避难所推测

6.2 结果与分析

6.2.1 MaxEnt模型评价

6.2.2 适生性分布预测结果

6.2.3 适生区分布变化及避难所推测

6.2.4 主要适生环境因子分析

6.3 讨论

第七章 枣食芽象甲种群历史动态及扩散路径分析

7.1 材料与方法

7.1.1 种群历史动态分析

7.1.2 种群分歧时间估算

7.1.3 种群历史迁移率分析

7.1.4 种群扩散路径预测

7.2 结果与分析

7.2.1 种群历史动态分析

7.2.2 种群分歧时间估算

7.2.3 种群历史迁移率分析

7.2.4 种群扩散路径预测

7.3 讨论

第八章 全文总结与研究展望

8.1 全文主要结论

8.2 本文创新点

8.3 问题与展望

参考文献

附录A 8个微卫星位点在不同种群中的等位基因数量及频率

附录B Worldclim环境变量指标值名称

附录C 枣食芽象甲不同类群相邻种群间的迁移率

致谢

个人简历