小麦 (Triticum aestivum L.)TaNADK1/2的功能及其与TaCaMs的互作关系分析

摘要

钙信号(Ca2+signaling)和NAD信号(NAD signaling)是生物体内两类重要的信号通路，其在细胞信号转导、能量代谢、逆境响应和各种生物学过程中发挥着关键性的作用。钙调蛋白(calmodulin,CaM)和NAD激酶(NAD kinase,NADK)是连接这两个信号网络的重要枢纽蛋白，许多研究表明CaM对NADK具有激活作用，但二者之间的互作关系及其生物学意义仍不明确。本研究采用生物信息学与分子生物学相结合的方法，对小麦TaNADK1和TaNADK2基因的基本功能进行了探索，并初步证明了小麦CaM与NADK之间存在互作关系，取得具体的研究结果如下： 1.通过实时定量PCR技术，对小麦TaNADK1和TaNADK2基因进行了表达模式分析。组织表达模式结果表明这两个基因具有明显的组织表达特异性，TaNADK1主要在小麦的穗中表达，而TaNADK2主要在小麦的叶与根中表达；诱导表达模式结果显示，TaNADK1和TaNADK2基因的表达均受到脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、生长素（IAA）及甲基紫精（MV）的诱导。此外，通过构建TaNADK1/2的超表达载体，侵染野生型拟南芥花序，获得了TaNADK1和TaNADK2过表达的拟南芥稳转株系；通过SWISS-MODEL建模、提取过表达拟南芥的总蛋白进行免疫印迹分析以及分裂荧光素酶互补试验，发现TaNADK1和TaNADK2在植物体内存在多聚体形式。 2.根据已知的其他物种的CaM序列在小麦基因组数据库中进行比对，发掘到了40个小麦CaM家族成员。通过进化树构建、基因结构及蛋白结构分析将这40个小麦CaM编码基因分为14个等位基因和6个亚家族。制作拟南芥原生质体，通过瞬时转化法对6个CaM亚家族的代表成员进行了亚细胞定位分析，发现TaCaM1/2/4/5/9/12均定位于细胞质、细胞核与细胞膜。 3.构建TaCaMs与cLUC的融合载体及TaNADK1/2与nLUC的融合载体，使用分裂荧光素酶系统(Split Luc System)通过注射烟草叶片，初步发现小麦TaNADK1/2和TaCaM1/2/4/5/9之间存在互作关系，而TaCaM12与TaNADK1/2之间无互作关系。 综上所述，通过对小麦TaNADK1和TaNADK2基因的表达模式分析、TaNADK1和TaNADK2多聚体形式的证明、以及TaNADK1和TaNADK2过表达的拟南芥遗传转化株系的创制，为TaNADK1和TaNADK2功能的深入研究奠定了理论基础。通过在基因组水平上对小麦CaM家族基因的系统性鉴定，以及在分子层面上对TaCaMs与TaNADKs之间互作关系的初步证明，为深入了解小麦内TaCaMs调控TaNADKs的分子信号机制提供了重要参考。

目录

论文说明

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第一章 文献综述

1.1 NAD信号与NADK研究进展

1.1.1 NAD(H)与NADP(H)的功能

1.1.2 NADK对NADP(H)和NAD(H)平衡的调节

1.2 钙信号与CaM研究进展

1.3 CaM激活NADK的研究进展

1.3.1 CaM激活NADK的研究现状

1.3.2 影响CaM激活NADK的结构

1.3.3 CaM对NADK的直接激活与间接激活机制

1.4 本研究目的意义及立题依据

1.5 研究内容和技术路线

1.5.1 小麦TaNADK1/2基因表达模式分析

1.5.2 TaNADK1/2拟南芥过表达转基因株系的获得

1.5.3 TaNADK1/2同源多聚体形式的证明

1.5.4 小麦TaCaM 家族生物信息学分析及克隆

1.5.5 TaCaMs与TaNADK1/2互作关系的验证

1.5.6 技术路线

第二章 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种信息

2.1.3 试剂

2.2 引物设计

2.2.1 TaNADK1和TaNADK2定量引物设计

2.2.2 TaNADK1和TaNADK2超表达载体构建引物及拟南芥鉴定引物设计

2.2.3 TaCaM家族基因克隆引物设计

2.2.4 TaCaMs亚细胞定位引物设计

2.2.5 TaNADKs和TaCaMs分裂荧光素酶互补试验引物设计

2.3 试验方法

2.3.1材料制备方法

2.3.3 拟南芥DNA、RNA及总蛋白的提取

2.3.4 qRT-PCR分析基因表达量

2.3.5 TaCaM家族基因克隆

2.3.6 载体改建方法及载体构建方法

2.3.7 农杆菌转化法

2.3.8 拟南芥花浸转染法

2.3.9 Gus组织化学染色

2.3.11 萤火虫荧光素酶互补试验

2.3.12 拟南芥原生质体瞬时转化方法

2.3.13 生物信息学分析方法总结

第三章 结果与讨论

3.1 TaNADK1和TaNADK2基因的表达模式

3.1.1 组织表达模式

3.1.2 诱导表达模式

3.2 TaNADK1和TaNADK2拟南芥过表达转基因株系的鉴定

3.3 TaNADK1和TaNADK2同源多聚体形式鉴定

3.3.1 TaNADK1和TaNADK2同源建模蛋白三维结构

3.3.3 非变性胶蛋白印迹结果

3.4 TaCaM家族基因的生物信息学分析及克隆

3.4.1 TaCaM家族基因的鉴定及命名

3.4.2 TaCaM家族系统发育关系及亚家族分类

3.4.3 TaCaM家族基因结构、结构域组成及蛋白三维结构分析

3.4.4 TaCaM家族基因的芯片数据分析

3.4.5 TaCaM家族基因的克隆

3.5 TaCaMs的亚细胞定位

3.6 TaCaMs与TaNADKs互作关系的建立

3.7 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 创新点

4.3 展望

参考文献

附录

致谢

作者简介