MtENOD20在蒺藜苜蓿共生固氮过程中的功能研究

摘要

本试验以蒺藜苜蓿为研究对象，对实验室前期筛选出的Phytocyanins基因家族中的早期结瘤素基因MtENOD20（MTR_4g130800）进行组织定位、亚细胞定位、RNA干扰和过量表达等分析，探究其在共生固氮中的功能。研究结果简述如下： 1、目的基因的表达模式分析 利用qPCR方法分析了早期结瘤素基因MtENOD20的两个可变剪接MtENOD20-1、MtENOD20-2在蒺藜苜蓿共生结瘤过程中的时空表达情况，结果表明（1）MtENOD20-1与MtENOD20-2在接菌的根中均被强烈诱导但表达谱不同，在不接菌对照根中不表达或仅有低水平的表达；（2）MtENDO20-1在不接菌和接菌植物的去瘤根、茎、叶中几乎不表达，只在根瘤中表达，为结瘤特异性表达；MtENDO20-2在接菌植物的去瘤根、茎、叶表达量较低，在根瘤中高水平表达，为结瘤增强性表达。推测MtENOD20的两个可变剪接在根瘤发育中可能行使着不同的功能。 2、MtENOD20的组织特异性表达 构建MtENOD20启动子与GUS融合表达载体，通过发根农杆菌介导的转化体系，对转化根进行GUS染色观察。结果显示，目的基因主要在侵染根的皮层细胞（即根瘤原基起始的部位）、含有侵染线的根毛细胞以及根瘤侵染区表达。 3、MtENOD20的亚细胞定位 构建MtENOD20基因的亚细胞定位载体，利用根癌农杆菌介导的烟草叶片细胞瞬时转化体系明确了MtENOD20定位在质膜、内质网和细胞核上；发根农杆菌介导的蒺藜苜蓿根部转化体系试验表明，MtENOD20定位于共生体上。这些结果表明MtENOD20可能通过内质网的分泌途径靶向共生体。 4、MtENOD20基因RNA干扰和过量表达转化植株的表型分析 对MtENOD20进行干扰处理，结果显示：干扰植株的株高、根长减少，根瘤数目、固氮酶活和豆血红蛋白含量降低，且根瘤多为小的白色无效根瘤；接菌后7d的侵染事件统计结果表明，干扰植株中卷曲根毛、延伸的侵染线、侵染线和根瘤原基的数目均降低与对照相比；根瘤石蜡切片和透射电镜观察结果表明，与野生型相比，干扰根瘤中的类菌体分化程度低，为不具有固氮活性的I类或者II类类菌体，共生关系过早终止。共生相关基因的表达分析显示，与对照相比，干扰根中与侵染相关的基因MtNSP1、MtERN1、MtERN2和MtERN3没有变化，MtNIN、MtENOD11和MtENOD40表达量下降，推测目的基因可能在MtNSP和MtERN下游发挥作用；与类菌体分化相关的基因RSD、DNF2、NCR001和NCR035，在干扰根中均显著降低。以上结果表明，MtENOD20可能与根瘤菌的侵染过程及类菌体的释放、分化有关。 过表达分析结果显示，MtENOD20过表达植株的株高、根长、根部的干重和鲜重及叶绿素的含量均增加，根瘤的数目、固氮酶活和豆血红蛋白含量上升；侵染事件统计分析结果表明，接菌后7d，过表达根中根毛卷曲、延伸侵染线、侵染线和根瘤原基的数目与对照相比均增加；接菌后45d根瘤石蜡切片和透射电镜观察结果显示，过量表达根瘤细胞中的类菌体形态规则，排列紧密，对照组根瘤中的类菌体数量减少且出现融合现象，表明对照的根瘤细胞开始衰老。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1.1生物固氮

1.1.2 豆科植物—根瘤菌共生关系的建立

1.1.3 Phytocyanin基因家族在豆科植物中的研究现状

1.2 研究目的及意义

1.3 技术路线

第二章MtENOD20时空表达及组织定位

2.1 引言

2.2.1 材料、载体、菌株

2.2.2 试剂及培养基

2.2.3 试验仪器

2.2.4 基因的生物信息学分析

2.3 实验方法

2.3.1 系统发育树的构建

2.3.2时空表达模式分析

2.3.2蒺藜苜蓿的栽培与采样

2.3.3 RNA的提取及反转录

2.3.4基因的定量分析

2.3.5基因组织定位载体构建

2.4.1 系统发育分析

2.4.2 RNA的检测与纯化

2.4.3 目的基因时空表达结果

2.4.4 MtENOD20启动子载体构建结果

2.4.5 MtENOD20组织表达特异性

2.5讨论

第三章 MtENOD20的亚细胞定位

3.1 引言

3.2.1 试验材料与试剂

3.2.2 试验仪器

3.3 试验方法

3.3.1 烟草叶片亚细胞定位载体的构建

3.3.2 根癌农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化

3.3.3 发根农杆菌介导的蒺藜苜蓿根部的转化体系

3.4 结果与分析

3.4.1 亚细胞定位载体的构建

3.4.2 亚细胞定位结果

3.5 讨论

第四章 MtENOD20的RNA沉默和过量表达

4.1 引言

4.2.1 材料、载体、菌株

4.2.2 试剂及培养基

4.2.3 试验仪器

4.3 试验方法

4.3.1 RNA干扰载体的构建

4.3.2 构建MtENOD20过量表达载体

4.3.3 蒺藜苜蓿发根转化体系

4.3.4 实验结果的鉴定

4.4 结果与分析

4.4.1 MtENOD20目的片段的扩增

4.4.2 RNA沉默载体的构建

4.4.3 构建过量表达载体

4.4.4 转化苗植株表型的观察

4.4.5 检测RNA干扰及过量表达的效率

4.4.6 转化植株的表型

4.4.7 RNA干扰植株中相关基因的表达

4.4.8 根瘤的显微及超显微结构观察

4.4.9 冷冻切片和扫描电镜对干扰的根瘤显微及超显微结构的观察

4.5 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介