硫化氢信号分子在刺槐-根瘤菌共生固氮体系中的作用研究

摘要

刺槐是一种木本豆科植物，是生态绿化的先锋树种，但在植被恢复过程中，氮素缺乏是影响刺槐树木生长主要限制因素。因此，如何调动豆科植物与根瘤菌共生固氮体系自身的固氮潜力，具有极其重要的意义。 硫化氢（Hydrogen Sulfide,H2S）作为新的气体信号分子，在调控植物生理功能方面具有重要作用，例如：H2S可以调控植物适应高盐胁迫、离子毒害、干旱胁迫和温度胁迫等，进而促进植物的生长发育。前人研究表明：一氧化氮（Nitric Oxide，NO）作为气体信号分子可以通过调控结瘤过程中关键基因的表达而影响豆科植物根瘤的形成和衰老，并最终影响豆科植物共生固氮能力。那么，同样作为气体信号分子的H2S是否也涉及调控豆科植物根瘤形成和共生固氮过程？本研究以刺槐-根瘤菌共生体系为实验对象，从植物表型分析、生理生化指标测定、根瘤形态和结构、共生基因表达并结合转录组技术分析H2S信号分子在刺槐-根瘤菌共生体系中根瘤形成和固氮过程中的作用机制。取得如下主要结果： （1）用H2S供体NaHS处理刺槐幼苗，结果发现外源H2S可以促进刺槐幼苗的生长发育，提高根长、株高和干重等生理指标，增加叶片叶绿素含量。同时，H2S也可以影响侵染事件，促进刺槐根瘤的形成和发育，进而提高根瘤固氮酶活性。 （2）通过石蜡切片和透射电镜对根瘤微观结构的观察发现，用H2S供体NaHS处理，在根瘤形成的早期阶段能促进根瘤的发育，成熟阶段根瘤内固氮区增大、侵染细胞排列更加紧密、数量更多、形态也更加圆润饱满、更具有活力；超微结构观察类菌体也有同样的结果。 （3）共生相关基因的qRT-PCR数据表明：H2S供体NaHS处理使刺槐根中钙离子和钙调素依赖性蛋白激酶基因（CCaMK）、钙离子通道蛋白基因（Castor）、核内卷曲螺旋蛋白基因（CYCLOP）、E3泛素连接酶基因（Cerberus）等表达量都显著上调；同时也可以引起假定共生受体激酶基因（SYMRK）和组氨酸蛋白激酶基因（LHK）在根瘤刚成熟时期表达量上调；还发现NaHS处理使刺槐根瘤中共生相关基因nodC和nifH等表达量显著上调。 （4）通过转录组分析发现，H2S供体NaHS处理编码膜蛋白、过氧化物酶、氧化还原酶、磷酸转移酶和组氨酸蛋白激酶的基因表达量上调，以及蔗糖和淀粉等糖类物质的代谢和合成、氮代谢、ATP结合、生物碱等次生代谢产物的合成、植物和微生物互作、跨膜信号转导、多种氨基酸的代谢和谷胱甘肽代谢等通路显著上调，说明H2S可以通过影响糖代谢提供更多的能量满足共生固氮过程的消耗提高固氮能力，参与抗氧化防御反应，促进刺槐根瘤的形成和发育，进而影响植株生长。此外，H2S还可以显著上调转录因子、转运蛋白、剪接体、RNA运输等基因。由此可见，H2S对刺槐植物共生固氮的调控是个复杂精细的过程。 以上结果表明：H2S发挥作用可以通过上调刺槐植株和根瘤菌中共生基因和许多代谢途径基因的表达，促进根瘤的形成和发育，提高了根瘤中固氮酶的活性，增强固氮的效率，使叶片叶绿素含量增加，促进刺槐的光合作用，增加生物量的积累，最终促进刺槐的生长。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1生物固氮

1.2.1豆科植物

1.2.2根瘤菌

1.2.3共生器官—根瘤

1.2.4根瘤类型

1.2.5刺槐与根瘤菌共生固氮

1.3.1植物激素对豆科植物共生固氮的调控

1.3.2气体信号分子对豆科植物的调控

1.4.1 H2S的理化性质

1.4.2 H2S在植物体中的形成过程

1.5.1参与植物气孔调节

1.5.2促进种子萌发和根部发育

1.5.3增强植物的光合作用

1.5.4降低离子毒害

1.5.5延长花期及调控衰老

1.5.6缓解非生物胁迫

1.6研究目的

1.7技术路线

第二章 材料与方法

2.1.1 种子处理

2.1.2 接菌和加H2S处理

2.1.3 样品收集

2.2 研究方法

2.3 测定项目

2.3.1 生理指标测定

2.3.2 根瘤形态和结构观察

2.3.3 刺槐共生相关基因表达分析

2.3.4 H2S处理刺槐根的转录组分析

2.4 数理统计

第三章 结果与分析

3.1 H2S对刺槐生理指标的影响

3.1.1 H2S对刺槐表型、根长、株高和生物量的影响

3.1.2 H2S对刺槐叶绿素含量的影响

3.1.3 H2S对刺槐根瘤数和固氮酶活的影响

3.1.4 H2S对刺槐植株地上部氮含量的影响

3.1.5 侵染事件统计

3.2 根瘤结构观察

3.2.1 石蜡切片观察根瘤结构

3.2.2 透射电镜观察根瘤超微结构

3.3.1 RNA质量检测

3.3.2共生相关基因在刺槐根中的表达情况

3.3.3 共生相关基因在刺槐叶中的表达情况

3.3.4 共生结瘤相关基因在刺槐根瘤中的表达情况

3.4.1 RNA样品检测结果

3.4.2 测序数据质量评估

3.4.3 基因差异表达分析

第四章 讨论

4.1 H2S对刺槐植株生长的影响

4.2 H2S对刺槐固氮共生体系固氮效率的影响

4.3 H2S对刺槐结瘤和根瘤结构的影响

4.4 H2S对刺槐共生基因表达的影响

4.5 H2S处理后的刺槐转录组分析

第五章 结论与展望

5.1 本文结论

5.2 展望

参考文献

附录

致谢

个人简历